Fille d'un ingénieur et d'une prof de maths, Catherine Frot entre à 17 ans à l'École de la Rue Blanche, puis au Conservatoire. Co-fondatrice en 1978 de la Compagnie du Chapeau Rouge, à laquelle se joindra bientôt Jean-Pierre Darroussin, elle fait sa première apparition à l'écran en 1980 dans Mon oncle d'Amérique de Resnais. Tout en continuant de se consacrer essentiellement au théâtre, elle trouve quelques petits rôles au cinéma (Psy, Elsa, Elsa, Chambre à part). Voisine de Robin Renucci dans Escalier C, elle obtient pour cette prestation une nomination au César du meilleur second rôle.
Au milieu des années 90, Catherine Frot triomphe sur les planches dans Un air de famille, le spectacle d'Agnès Jaoui et de Jean-Pierre Bacri : elle y interprète Yoyo, la belle-soeur nunuche, un personnage drôle et attendrissant qui lui vaut le Molière du second rôle. Lorsque Cédric Klapisch adapte la pièce à l'écran, le succès est encore au rendez-vous, et l'actrice décroche un César en 1997. Abonnée aux rôles de bourgeoise un peu pincée, elle enchaîne alors les comédies : maîtresse de Thierry Lhermitte dans Le Dîner de cons de Francis Veber (1998), elle apparaît également dans Paparazzi puis La Nouvelle Eve .
En 1999, Catherine Frot est pour la première fois en haut de l'affiche grâce à La Dilettante, succès-surprise de Pascal Thomas, dans lequel elle campe une provinciale au caractère bien trempé. Elle retrouvera plus tard le cinéaste, à l'occasion d'une joyeuse virée chez Agatha Christie (Mon petit doigt m'a dit, 2005) dans lequel elle joue les détectives. Avec sa voix un rien gouailleuse, l'actrice s'illustre dans des comédies (Chouchou, 7 ans de mariage) qui assoient encore un peu plus sa popularité.
Mais elle dévoile bientôt d'autres facettes de son talent : vedette de Chaos (2001), film engagé de Coline Serreau, elle incarne avec retenue la terroriste repentie de la trilogie de Lucas Belvaux (2003), la pianiste secrète de La Tourneuse de pages (2006) ou la mère inquiète de L' Empreinte de l'ange. Héroïne d'oeuvres qui revisitent le patrimoine national (Vipère Au Poing, Boudu), Frot ajoute aussi de nouveaux spécimens à sa galerie de femmes candides et décalées (Les Soeurs fâchées en 2005, Odette Toulemonde en 2007). S'essayant au film d'animation (Cendrillon & le prince (pas trop) charmant), elle se grime en vieille dame pour les besoins du Vilain d’Albert Dupontel. Elle alterne comédies grand public (Imogène McCarthery) et projets plus singuliers (Les Derniers jours du monde en 2009, le polar social Coup d'éclat en 2011), en s’efforçant de faire jaillir l’humanité de chacun de ses personnages.