Ce n'est pas la passion pour l'art dramatique qui amène Matthew Lillard à se lancer dans une carrière d'acteur : s'il joue dans les pièces de théâtre de son lycée, c'est pour oublier ses problèmes scolaires. Il obtient néanmoins son diplôme et entre à l'American Academy of Dramatic Arts de Pasedena en Californie. En 1991, l'acteur déménage à New York, où il obtient un petit rôle sur le film d'horreur Ghoulies 3. Il apparaît parfois dans des films romantiques (De l'amour à la folie, 1995), mais c'est dans le genre du thriller qu'il se démarque et fait ses preuves à travers des films comme Serial Mother (1994) ou Hackers (1995).

C'est son interprétation de Stuart Macher dans le film d'épouvante Scream (1996) de Wes Craven qui le fait remarquer auprès du grand public. Grâce au succès du film, Lillard parvient à décrocher de nombreux premiers rôles (Cursus fatal, 1998 ; Telling You, id.). Dans la comédie Elle est trop bien (1999), il joue pour la première fois avec un acteur qu'il retrouvera à plusieurs reprises dans sa carrière : Freddie Prinze Jr.. Après le film d'horreur 13 fantômes (2001), l'acteur change complètement de style avec Scooby-Doo (2002) et sa suite (2004), où il interprète le personnage maladroit de Sammy aux côtés de Freddie Prinze Jr. et Sarah Michelle Gellar.

Dans Rencontre à Wicker Park (2004), Matthew Lillard tente d'aider Josh Hartnett à retrouver une femme disparue. Après un passage dans quelques séries et téléfilms, il joue dans le film d'héroïc fantasy King Rising, Au Nom Du Roi (2006) et retrouve la comédie en 2009 avec Herman Spooner de Drake Doremus. Il interprète ensuite la victime d'un serial-killer dans Messages Deleted et s'envole ensuite pour Hawaï avec George Clooney pour The Descendants (2011) d'Alexander Payne. Dans Une nouvelle chance (2012), il partage sa passion du base-ball avec Clint Eastwood.

Privilégiant son personnage de Sammy dans Scooby-Doo, Matthew lui prête sa voix dans de nombreux dessins animés (séries et longs métrages), comme Scooby-Doo et la colonie de la peur, Scooby Doo, Abracadabra-Doo, Scooby-Doo : Mystères associés, Scooby-Doo! La légende du Phantosaur, Scooby-Doo : tous en piste, Scooby-Doo ! Aventures en Transylvanie, Scooby-Doo et le monstre de l'espace, Lego Scooby-Doo ! Mystère sur la plage, Scooby-Doo et le fantôme gourmand, Scooby-Doo et Krypto ! ou encore Scooby-Doo! And the Mystery Pups.

En parallèle, Matthew Lillard campe un personnage régulier dans la série policière The Bridge et rejoint le casting de l'émouvant Life Of Chuck. Toujours friand d'horreur, le comédien incarne également William Afton "Purple Guy", principal antagoniste de la lucrative franchise Five Nights at Freddy's. On le verra aussi en 2026 dans la peau du Principal du lycée au centre de la série Carrie de Mike Flanagan.