Né en Roumanie, Sebastian Stan et sa mère déménagent à Vienne lorsqu'il a 8 ans. 4 ans plus tard, il suit sa mère à New-York lorsque cette dernière épouse le directeur d'une école privée de la ville. Durant ses années dans "La Grosse Pomme", il étudie au Rockland Country Day School et joue dans plusieurs scènes théâtrales. Il participe également à plusieurs productions au camp d'été du Stagedoor Manor ; cette expérience le pousse alors à se diriger plus sérieusement vers une carrière d'acteur.

Diplômé par la suite de l'Université Rutgers du New Jersey, il passe une année à Londres en jouant au Shakespeare's Globe Theatre. À son retour aux Etats-Unis, Sebastian commence à tourner dans des films indépendants tels que Tony N'Tina's Wedding, Red Doors ou bien encore The Architect. Parallèlement, il apparaît dans des séries comme New-York, Police Judiciaire avant d'obtenir un rôle plus récurrent dans Gossip Girl (2007-2009). 

Surfant sur sa relative notoriété, on le retrouve de plus en plus dans des films en vue tels que Rachel se marie, Toy Boy ou bien Black Swan. Mais c'est en 2011 que sa carrière prend un tournant non négligeable lorsqu'il interprète Bucky Barnes, le meilleur ami de Captain America dans Captain America : First Avenger. Dans la foulée, il intègre le casting de la série Once Upon A Time par le biais du rôle du Chapelier Fou et joue dans la mini-série Political Animals, retraçant le parcours politique de Elaine Barrish. 

Sebastian Stan reprend son rôle de Bucky Barnes dans Captain America, Le Soldat de l'Hiver en 2014, incarnant le redoutable Soldat de l'Hiver, puis dans le troisième volet de la lucrative franchise, Captain America Civil War (2016). Entre ces deux films Marvel, l'acteur campe l’un des trois enfants de Meryl Streep dans Ricki and the Flash et cherche à sauver Matt Damon qui se retrouve Seul sur Mars. On le voit ensuite en mari violent dans Moi, Tonya (2017) et en shérif corrompu dans Le Diable, tout le temps (2020).

Parallèlement à son engagement sur le MCU (Avengers: Infinity War, Endgame, Falcon et le Soldat de l'hiver, Captain America: Brave New World et Thunderbolts*), Sebastian joue aussi dans le très sombre film de braquage Destroyer, la romance dramatique Monday, le film d'arnaque Sharper et la comédie noire Fresh, où il incarne un tueur en série avide de chair humaine.

Il s'illustre aussi à la télévision, dans Falcon et le Soldat de l'hiver (2021), et Pam & Tommy (2022), qui revient sur l’histoire d’amour tumultueuse entre Pamela Anderson et Tommy Lee, ainsi que le scandale de leur sextape. Sa prestation dans la peau du batteur de Mötley Crüe lui vaut une nomination aux Emmy Awards et aux Golden Globes.

2024 marque un tournant dans sa carrière grâce à deux films. Le premier, le troublant A Different Man, le met dans la peau d'un homme qui, après une opération de reconstruction faciale, devient obsédé par un acteur qui joue son propre rôle. Le second, The Apprentice, est un biopic centré sur le parcours de Donald Trump. Ces deux performances lui permettent de décrocher deux nominations aux Golden Globes et une aux Oscars.

Avant de rempiler pour le MCU dans Avengers: Doomsday, l'acteur poursuit son incursion dans le cinéma d'auteur et renoue avec ses origines roumaines en tournant sous la direction de son compatriote Cristian Mungiu. Dans Fjord, Sebastian Stan joue un père de famille pieux dont les méthodes d'éducation traditionnelles sont remises en cause lorsqu'il est suspecté de violences envers ses enfants. Présenté au Festival de Cannes 2026, le drame remporte la Palme d'Or.