Jessie Lambotte se passionne très jeune pour la scène et suit ses premiers cours de théâtre dès ses 10 ans. Elle poursuit sa formation au Conservatoire national de région de Saint Maur, à l'université Paris X Nanterre (Maîtrise Arts du spectacle, cinéma/théâtre), au St Denis Actor's Studio avec Jack Garfein et à la Compagnie du Regard pour l'improvisation. Elle entame sa carrière en 2003 comme assistante du metteur en scène Gérard Darier sur la pièce Sacrés Jeudis. Parallèlement, elle découvre le doublage en assistant à quelques séances puis en faisant ses premiers essais.

Capable de jongler entre des tonalités enfantines, médium et graves, elle devient très active en studio d'enregistrement, et s'illustre vocalement dans de nombreuses séries (Umbrella Academy, Philadelphia, A la croisée des mondes, Outer Banks...) et plusieurs longs métrages (Better Man, Mean Girls, Annabelle, L'Exorciste Devotion...) ainsi que dans des programmes d'animation jeunesse (Les Frères Koalas, Willa ! ou Les Moodz dont elle assure également la direction artistique).

Jessie Lambotte est également très sollicitée dans le monde des animés, prêtant sa voix à des personnages emblématiques de L'Attaque des Titans, Food Wars !, Fairy Tail, Bleach, Black Clover, My Hero Academia ou One Punch Man. Les fans de Futurama la (re)connaissent également comme Amy, alors que ceux de Miraculous l'entendent régulièrement dans l'univers de Ladybug où elle campe alternativement Mademoiselle Bustier, Mylène, Nadia, Rose et Sabine.

Parallèlement, la comédienne apparaît dans de nombreux courts métrages et pièces, signe plusieurs mises en scène pour le théâtre, et devient la fameuse "voix du générique" du programme court Merci Qui ?, qui livre des anecdotes sur les plus grands films aux internautes d'AlloCiné. Elle joue également un rôle récurrent dans la websérie Dedans AlloCiné, primé au Festival de la Rochelle.