Diplômé en 2011 de l'école de théâtre Bristol Old Vic, Josh O'Connor peaufine son art sur les planches. Le jeune comédien croise brièvement Matt Smith pour les besoins d'un épisode de Doctor Who. Et il décroche en 2014 un rôle de second plan dans Peaky Blinders : celui de James, un écrivain sans le sou hébergé par Ada Thorne (Sophie Rundle) dans la saison 2 de la série à succès. La même année, le public britannique le découvre dans la peau de Bobby Grace, un jeune flic de la police londonienne dans la saison 3 de Ripper Street.
Sur le grand écran, Josh O'Connor se met à nu pour Hide and Seek, un long métrage indépendant dans lequel il forme un ménage à quatre, notamment avec Hannah Arterton. C'est en 2017 que sa carrière s'accélère. Son personnage de Johnny Saxby, un jeune fermier du Yorkshire qui tombe amoureux d'un saisonnier roumain dans Seule la terre, lui vaut le prix du Meilleur acteur aux British Independent Film Awards. Il renouvelle l'exploit deux ans plus tard en décrochant à nouveau le trophée pour sa prestation dans le touchant Only You.
Aîné de la fratrie dans La folle aventure des Durrell, l'acteur devient Marius dans la nouvelle adaptation des Misérables avec Dominic West et Ellie Bamber. Il se fait connaître auprès du grand public grâce au succès de la série Netflix The Crown, retraçant le parcours de la famille royale d'Angleterre. Dans les saisons 3 et 4, Josh O'Connor prête ses traits à Charles, le prince de Galles, futur héritier de la Couronne qui peine à s'affirmer au sein du clan. Ce rôle lui permet de remporter le Golden Globe du Meilleur acteur dans une série dramatique lors de la 78ème cérémonie.
Pris au coeur d'un conflit entre ses parents, Annette Bening et Bill Nighy, dans Goodbye, Josh O'Connor tente de séduire Anya Taylor-Joy dans la revisite de l'œuvre de Jane Austen, Emma. Et Simon Godwin lui confie le rôle principal masculin de son adaptation de Romeo & Juliet face à Jessie Buckley. Pour Mothering Sunday, il retrouve sa partenaire de The Crown Olivia Colman et entretient une liaison secrète avec la domestique (Odessa Young) de ses voisins dans l'Angleterre post-Première Guerre mondiale.
De plus en plus sollicité, il tourne sous la direction de cinéastes en vue, comme Alice Rohrwacher (La Chimère où il fait du commerce clandestin d'objets d'art historiques tout en étant obsédé par un amour passé), Luca Guadagnino (le triangle amoureux Challengers sur fond de compétition sportive), et Kelly Reichardt (The Mastermind, sur un trafiquant d'œuvres d'art en cavale). Ce dernier est présenté en compétition au Festival de Cannes 2025, tout comme Le Son des souvenirs d'Oliver Hermanus, un drame sentimental où il donne la réplique à Paul Mescal.
Preuve de sa popularité, Josh O'Connor apparaît également dans des grosses productions. Ainsi, le public peut le voir fin 2025 sur Netflix en prêtre dans Wake Up Dead Man : Une histoire à couteaux tirés, troisième volet des aventures du détective Benoît Blanc au casting aussi impressionnant que celui de ses prédécesseurs (Daniel Craig, Josh Brolin, Andrew Scott, Glenn Close, Mila Kunis). Quelques mois plus tard, il est à l'affiche de Disclosure Day, qui n'est rien de moins que le retour de Steven Spielberg à son sujet de prédilection : les extra-terrestres.
Pascal Muscarnera