Pour ce film, Artus de Penguern a fait appel aux mêmes acteurs que dans ces cours métrages, des humoristes issus du Café-théâtre pour la plupart. "J'ai demandé à des comédiens, que je trouve excellents, de travailler gratuitement ou très mal payés, dans mes courts. Si maintenant que je fais un long, je leur disais que je préfère travailler avec des "vedettes", je me conduirais comme un gros dégonflé..." explique-t-il.
Si le tournage de Grégoire Moulin contre l'humanité s'est déroulé en majeure partie à Paris, dans le XVIème arrondissement, l'équipe a pu également expérimenter, bien que dans une moindre mesure, les joies du tournage en province, à Lyon, où la population a su faire preuve de plus de coopération et d'enthousiasme que dans la capitale.