Né dans le sud de Chicago, Neil Flynn grandit à Waukegan où il étudie à la Waukegan East High School dans laquelle il remporte le prix régional du duo comique avec l'un de ses camarades. Par la suite, il retournera à Chicago avec un diplôme de l'université Bradley de Péora.

Sa carrière débute par des petites apparitions dans des séries telles que Demain à la Une et L'Enfer du devoir. Il enchaîne avec des rôles un peu plus consistants dans de nombreuses séries comme That 70's Show, Les Experts et Smallville... Sa prestation la plus marquante reste celle du concierge dans Scrubs. Engagé au départ seulement pour quelques épisodes, son personnage devient vite régulier, face à l'accueil réservé par le public.

Au cinéma, Neil Flynn se fait remarquer avec des petits rôles dans des films comme Magnolia, Maman, je m'occupe des méchants, Lolita malgré moi ou même Le Fugitif. En 2008 il retrouve Harrison Ford dans le très attendu Indiana Jones et le Royaume du Crâne de Cristal dans lequel il joue un agent du F.B.I..