John Singleton suit des études de cinéma à l'USC (University of Southern California), où il est le lauréat à la fin des années 80 de trois bourses d'écriture (le Jack Nicholson Award en 1989 et en 1990, et le Robert Riskin Award en 1989). Il rejoint, lors de sa dernière année d'études, la Creative Artists Agency et vend dès cette époque le scénario de Boyz'n the Hood, la loi de la rue, chronique des difficultés sociales d'une bande de jeunes dans un ghetto de Los Angeles, qu'il réalise en 1991. C'est une révélation : John Singleton devient le plus jeune artiste cité conjointement à l'Oscar du Meilleur réalisateur et du meilleur scénario.

Parrainé par Spike Lee, que John Singleton considère comme son père spirituel, le cinéaste tente de retrouver la veine de ce premier coup d'éclat avec le drame Poetic Justice (1993), où il met en scène Janet Jackson et Tupac Shakur, ainsi que dans Higher learning deux ans plus tard, sans jamais toutefois retrouver les faveurs critiques et publiques de Boyz'n the Hood. En 2000, John Singleton renoue avec le succès en offrant une nouvelle jeunesse au personnage mythique de Shaft, incarné par Samuel L. Jackson, puis reprend les commandes laissées vacantes par Rob Cohen pour tourner la suite du film d'action Fast & furious, Fast and furious 2.

En 2005, il revient au polar urbain avec Quatre frères, dans lequel il dirige une nouvelle fois Tyrese Gibson. Au casting du film figurent aussi Mark Wahlberg, Terrence Howard, Chiwetel Ejiofor ou encore le rappeur André Benjamin. Six ans après, Singleton réalise Identité Secrète, un thriller d'action dans la veine de La Mémoire dans la peau, où des acteurs confirmés comme Alfred Molina ou Sigourney Weaver épaulent la star montante Taylor Lautner.