Dès l’adolescence, Anthony Mackie se destine à embrasser une carrière acteur. Il entre ainsi, à 18 ans, dans la très réputée Juilliard School de New York d’où il sort diplômé en 2001. Il commence alors à se produire dans des pièces de théâtre Off-Broadway et gagne même un prix pour son rôle dans la pièce "Talk" de Carl Hancock Rux. En 2010, il donne la réplique à Christopher Walken sur une scène de Broadway à l'occasion de la pièce "A Behanding in Spokane". En parallèle, il passe plusieurs castings pour le cinéma.

C'est en 2003 qu'Anthony débute au cinéma, prêtant ses traits au rappeur rival d’Eminem dans 8 Mile. En 2009, il incarne un autre rappeur, le célèbre Tupac Shakur, dans le biopic Notorious B.I.G.. Par la suite, le comédien joue des seconds rôles aux côtés d’acteurs de renom comme Harrison Ford (Hollywood Homicide, 2003), Denzel Washington et Meryl Streep (Un Crime dans la tête, 2004), Clint Eastwood (Million Dollar Baby, 2005) et Samuel L. Jackson (Le Boss, 2006).

C’est pourtant assez tôt dans sa carrière qu’Anthony Mackie obtient un premier rôle. En 2004, il est choisi par Spike Lee pour incarner le héros de She Hate Me qui, malheureusement, passe un peu inaperçu. Toujours en 2004, il est le personnage principal du petit film indépendant Brother To Brother dans lequel il joue un artiste homosexuel. Il faut attendre 2009 pour que l’acteur se fasse réellement remarquer grâce à son rôle dans l’oscarisé Démineurs de Kathryn Bigelow.

En 2010, il participe à Fleur du désert mais c’est l’année suivante que les choses s’accélèrent. Anthony Mackie est en effet à l’affiche de trois films : la romance teintée de science fiction L'Agence, la comédie (S)ex List et le film de boxe robotique Real Steel avec Hugh Jackman. Il réitère l'exploit en 2012 avec le thriller Dos au mur, le fantastique Abraham Lincoln : Chasseur de Vampires et le violent polar The Gangster Squad où il tente de mettre fin au règne du gangster Mickey Cohen (Sean Penn).

Très actif, Anthony Mackie est l'un des trois kidnappeurs amateurs bodybuildés dans No Pain No Gain puis est choisi par Marvel pour se glisser dans la peau de Sam Wilson / Le Faucon prêtant main forte à Steve Rogers / Captain America. Ainsi, l'acteur apparaît dans Captain America, le soldat de l'hiver, Avengers : L'ère d'Ultron, Ant-Man, Captain America: Civil War, Avengers: Infinity War, Avengers: Endgame et la série Falcon et le Soldat de l'Hiver, qui se déroule après les événements d'Endgame.

Parallèlement à l'univers Marvel, Anthony Mackie joue des personnages secondaires dans Le Cinquième pouvoir (2013), Black or White (2014), Comment séduire une amie (2015) et Que le meilleur gagne (id.). Ses rôles gagnant en importance, il incarne ensuite un policier dans le très sombre Triple 9 (2016), Martin Luther King dans le biopic All The Way (id.), un médecin urgentiste pris dans une spirale infernale dans Point Blank (2019) et un androïde militaire dans Zone Hostile (2021).

On le voit aussi dans la peau de l'homme d'affaires Bernard Garrett dans The Banker de George Nolfi. Mais surtout, il reprend son personnage de Sam Wilson (qui, cette fois, est au centre du film) dans la série Falcon et le Soldat de l'hiver et dans le 35ème blockbuster du MCU, Captain America: Brave New World, qui sort en 2025.