Formée au métier de comédienne à l'Actors Studio, Jennifer Esposito doit d'abord se contenter d'un emploi de serveuse avant d'apparaître pour la première fois à l'écran dans la série télévisée The City en 1995, diffusée sur ABC. De 1997 à 1999, elle joue dans le feuilleton Spin City, où elle interprète Stacy, la secrétaire sarcastique et exubérante du maire de New York, incarné par Michael J. Fox.

En 1997, l’actrice fait ses débuts au cinéma en apparaissant brièvement dans A brother's kiss, un drame de Seth Zvi Rosenfeld. Elle enchaîne ensuite les petits rôles aux côtés d'Edward Burns dans Quitte ou double, de Denzel Washington dans He Got Game et de Freddie Prinze Jr. dans Souviens-toi... l'été dernier 2, avant d'être révélée au grand public par Summer of Sam de Spike Lee en 1999.

Ses origines italiennes lui confèrent un charme dont elle sait user dans ses films. Ainsi, Jennifer fait partie des nombreuses prétendantes à vouloir se marier avec Chris O'Donnell dans Le Célibataire et se transforme en séduisante femme vampire pour les besoins de Dracula 2001. Prêtant main forte à Michael Douglas dans le thriller Pas un mot, elle séduit Sam Rockwell dans la comédie Bienvenue à Collinwood, puis entre en Collision avec une pléiade d'acteurs, parmi lesquels Matt Dillon, Thandie Newton et Brendan Fraser, dans un film-chorale réalisé par le scénariste Paul Haggis en 2004.

Après une fournée d’épisodes dans la dramatique Amy et le pilote avorté More, Patience, Esposito se découvre un lien de parenté avec Lizzy Caplan dans la très vite annulée Related en 2006, focalisée sur quatre sœurs habitant à Brooklyn. La jeune femme rend par la suite visite aux pompiers de Rescue Me, les héros du 11 septembre, charmant Denis Leary pour l’occasion. Cumulant quelques longs-métrages ça et là (Passions sous la neige, American Crude), elle est accueillie à bras ouverts par Christina Applegate dont elle incarne la meilleure amie fêtarde dans la comédie Samantha Qui ?.

De 2010 à 2012, la comédienne est à l’affiche d’une production policière signée CBS, Blue Bloods, s’intéressant à une famille de flics faisant régner l’ordre et la justice dans la Grande Pomme. Elle est ainsi la toute première coéquipière de Donnie Wahlberg, la divorcée Jackie Curatola. Jennifer troque son badge pour une blouse blanche dans Taxi Brooklyn sous les traits du Dr Monica Peña, avant de devenir l’une des Mistresses de ABC le temps d’une saison estivale en endossant le rôle de la tourmentée et richissime Calista Raines. En 2016, elle vient combler le vide laissé par le départ de Michael Weatherly dans NCIS : Enquêtes spéciales, se glissant dans la peau de l’agent Alex Quinn, recrutée par Mark Harmon pour venir lui prêter main forte.