Née à Vancouver d’un père néerlandais et d’une mère anglaise, Jacoba Francisca Maria Smulders, surnommée "Cobie", n’est pas prédestinée à devenir actrice. Même si elle s’essaie à la comédie dans les spectacles de son lycée, elle entame d’abord une carrière de mannequin. Parallèlement à ses études, elle voyage en Europe, en Afrique et au Japon. Et elle est tout de même diplômée avec les félicitations en 2000.

Lassée par le milieu du mannequinat qu’elle juge trop superficiel, Cobie commence à passer des castings et se tourne finalement vers la comédie. Sa carrière débute par des rôles mineurs à la télévision. Elle joue dans la série de science-fiction Jeremiah en 2002 et apparaît aussi dans Tru Calling : compte à rebours dans la peau de Sarah Webb.

C’est en 2003 qu’elle obtient pour la première fois un rôle principal dans une série, elle donne ainsi la réplique à Eric Balfour dans Veritas : The Quest. Le show est annulé après une courte saison de 13 épisodes. Pourtant, Cobie se fait connaître du grand public en intégrant la bande d’amis d’How I Met Your Mother en 2005 où elle incarne Robin Scherbatsky. Considérée comme le nouveau Friends, la sitcom connaît un succès immédiat et devient vite l’un des hits de CBS.

Fort de sa nouvelle popularité, Cobie Smulders décroche son premier rôle marquant au cinéma en interprétant l’agent Maria Hill dans les blockbusters de Marvel (The Avengers, Captain America le Soldat de l’hiver). Un personnage qu’elle reprend dans le pilote de Marvel's Agents of S.H.I.E.L.D. la série de Joss Whedon inspirée justement de la franchise Marvel.