Pour son premier rôle, Peter MacNicol est la tête d'affiche du film fantastique Le Dragon du lac de feu en 1981. Sa mission : tuer le redoutable cracheur de feu. Après un second rôle aux côtés de Meryl Streep et Kevin Kline dans Le Choix de Sophie (1982), il s'oriente vers les comédies fantastiques, avec des prestations remarquées dans S.O.S Fantomes II (1989), Les Valeurs de la famille Addams (1993), ou encore Dracula, mort et heureux de l'être (1995). En 1997, il accompagne Rowan Atkinson dans la comédie loufoque Bean avant de participer à Rupture mode d'emploi (2004) avec Jamie Foxx.

C'est sur le petit écran que Peter MacNicol rassemble ses fans. Après des apparitions ou rôles récurrents dans Cheers (1993), Les contes de la crypte (1994) et Chicago Hope (1994), il devient en 1997 l'avocat déjanté et ami d'Ally McBeal. À l'arrêt de la série après 5 saisons, il prête sa voix à de nombreux personnages de dessins animés pour enfants, puis retrouve un rôle régulier en 2005 dans la série Numb3rs. Dans la peau d'un professeur de physique à l'université, il soutient et conseille Charlie (David Krumholtz) dans ses théories mathématiques complexes pour aider le FBI.