Une fois diplômée en arts dramatiques, Marg Helgenberger rejoint le soap Ryan's Hope en tant que personnage récurrent de 1982 à 1985. Quelques rôles de guest-star plus tard, elle se prostitue pour les soldats de la guerre du Vietnam dans les 4 saisons de China Beach (1988), rôle pour lequel elle remporte un Emmy en 1990.

Elle se fait remarquer sur grand écran en 1989 sous la direction de Steven Spielberg dans le drame fantastique Pour toujours. En 1995, elle se frotte aux Bad boys Will Smith et Martin Lawrence avant de côtoyer La Mutante, qu'elle retrouve dans sa suite, La Mutante 2 (1998). Après de nombreux téléfilms, elle se fait remarquer par Julia Roberts en victime dans Erin Brockovich, seule contre tous (2000).

Marg Helgenberger connaît également une riche carrière télévisuelle, avec notamment des apparitions dans Matlock (1987), Les Contes de la Crypte (1991) et Urgences (1996), où elle est l'objet des convoitises du personnage de George Clooney dans un arc de plusieurs épisodes. Mais c'est en 2001 que la consécration arrive pour l'actrice de 43 ans avec son rôle régulier dans l'immense succès sur CBS, Les Experts. Elle y incarne Catherine Willows, une spécialiste en analyses des tâches de sang qui travaille en étroite collaboration avec Gil Grissom (William L. Petersen). En 2014, l’actrice donne la réplique à Josh Holloway dans la série Intelligence. Elle interprète Lillian Strand, à la tête d’une agence gouvernementale à la pointe de la technologie.