Pauley Perrette déménage souvent dans son enfance, selon les mutations de son père, ce qui ne l'empêche pas d'obtenir une maîtrise en criminologie. Elle étudie également la sociologie et la psychologie, et reste passionnée par la science médico-légale.

Toutefois, c'est vers une carrière de comédienne qu'elle se tourne, dès 1994 à la télévision. Elle commence dans des séries comme Frasier et Demain à la Une, avant d'obtenir un rôle régulier dans la 2ème saison de Murder One (1996). Après de multiples autres apparitions (Philly, Dawson, 24, Les Experts), Pauley Perrette retrouve un rôle régulier de spécialiste en informatique dans NCIS : Enquêtes spéciales (2003).