Après une enfance passée dans une banlieue rurale de l'Ohio, Justin Chambers se rend en France à la fin de ses études secondaires. Remarqué par un agent dans le métro parisien, il débute une fructueuse carrière de top-model qui le ramène aux États-Unis au début des années 90. Tout en poursuivant ses activités de mannequin, il se tourne rapidement vers la télévision, et débute en 1995 dans le soap Another World. Il apparaît l'année suivante dans New York Undercover (1996).

Il fait ses premiers pas au cinéma en 2000 devant la caméra de Barry Levinson dans le drame Liberty Heights. Il connaît la révélation en 2001 avec Un mariage trop parfait d'Adam Shankman, dans lequel il incarne l'amoureux transi Massimo, qui tente désespérément d'obtenir la main de Jennifer Lopez. La même année, il tient le rôle principal de D'Artagnan (2001) de Peter Hyams.

Justin Chambers revient vers le petit écran en 2003 avec un rôle récurrent dans la série Cold Case, avant de rejoindre deux ans plus tard l'énorme succès d'ABC, Grey's Anatomy (2005). Dans cette série médicale, il joue un jeune interne prétentieux et arrogant aux côtés d'Ellen Pompeo et Patrick Dempsey.