Née d'une mère comptable d'origine italienne et d'un père qui les abandonne lorsqu'elle a deux ans, Sylvie Testud grandit dans le quartier populaire de la Croix-Rousse à Lyon. Très tôt fascinée par le cinéma, la jeune fille s'identifie notamment au personnage d'ado complexée incarné par Charlotte Gainsbourg dans L' Effrontée. Montée à Paris pour suivre des études d'histoire, elle se lance bientôt dans la comédie en intégrant la classe libre du Cours Florent puis le Conservatoire, où elle a pour professeurs Jacques Lassalle et Catherine Hiegel. Elle fait sa première apparition à l'écran en 1994 dans Couples et amants.

La même année, Sylvie Testud est engagée pour une coproduction franco-allemande, Maries Lied. Mais les Français se retirent du projet, et l'actrice est promue, lors de la sortie de ce film remarqué, jeune espoir du cinéma d'outre-Rhin. Pour Jenseits der Stille, elle apprend la langue de Goethe, mais aussi la clarinette et le langage des signes, une performance qui lui vaut l'équivalent allemand du César de la Meilleure actrice. C'est en 1999 que les Français découvrent le sourire malicieux de Sylvie Testud dans Karnaval, la chronique dunkerquoise de Thomas Vincent. Choisie par Akerman pour être l'héroïne de La Captive (2000), adaptation de La Prisonnière de Marcel Proust, elle apparaît ensuite chez Jacquot et Oliveira.

En 2000, l'actrice frêle et rieuse révèle une violence insoupçonnée en incarnant Christine Papin dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis, une prestation récompensée par un César du Meilleur espoir. Affectionnant les personnages troubles et décalés - serial killer dans Dédales, voleuse dans Filles uniques -, Sylvie Testud obtient en 2004 le César de la Meilleure actrice pour Stupeur et tremblements de Corneau, le récit plein d'ironie d'une descente aux enfers dans le monde de l'entreprise japonaise, d'après le best seller d'Amélie Nothomb. Devenue une actrice de premier plan, elle poursuit dans cette veine burlesque avec Cause toujours ! de Jeanne Labrune et Demain on déménage, de sa complice Akerman, mais c'est sur le terrain du mélodrame que l'emmène sa seconde collaboration avec Alain Corneau (Les Mots bleus, 2005).

Après avoir incarné une jeune femme prête à tout pour rejoindre l'homme de sa vie sur le front en 1917 dans La France, elle recherche le mystère Watteau aux côtés de Jean-Pierre Marielle dans Ce que mes yeux ont vu. Puis, elle participe en 2007 à la réussite internationale de La Môme en interprétant Mômone, l'amie d'enfance d'Edith Piaf. Sylvie Testud enchaîne les biopics en passant devant la caméra de Diane Kurys avec Pierre Palmade pour les besoins de Sagan, film éponyme sur l'écrivain célèbre à la vie tapageuse. En 2009, loin de ses rôles de composition, elle prête ses traits à la célèbre Calamity Jane dans Lucky Luke, adaptation de la cultissime BD signée Morris et René Goscinny.

Entre 2008 et 2011, cette actrice très présente sur les écrans français interprète notamment le rôle d'une paraplégique miraculée dans le très remarqué Lourdes, Daria Alexeïevna dans L' Idiot (adaptation du classique de Dostoievski), la célèbre militante anarchiste dans Louise Michel la rebelle, ou encore Chantal Legorjus dans le polémique L' Ordre et la morale, dirigé par Mathieu Kassovitz. Sylvie Testud retrouve Kassovitz en 2011 pour La Vie d'une autre. Cette fois-ci, les rôles s'inversent : elle prend en charge la réalisation et il interprète un des personnages principaux.

La comédienne travaille également à l'étranger devant la caméra de l'Anglais Charles Sturridge pour The Scapegoat et de la Russe Vera Glagoleva avec Two Women. En 2014, Sylvie Testud joue dans plusieurs films, parmi lesquels le thriller 96 Heures de Frédéric Schoendoerffer, le drame adapté d'un sordide fait divers 24 jours, la vérité sur l'affaire Ilan Halimi mis en scène par Alexandre Arcady ou la comédie Sous les jupes des filles, première réalisation d'Audrey Dana. L'année suivante, elle est au casting du premier film d'Alex Lutz, Le Talent de mes amis et dans un registre plus dramatique, joue une femme voyant débarquer dans sa vie la mère biologique de l'enfant qu'elle a adopté dans Au plus près du soleil d'Yves Angelo.

Tournant beaucoup, Sylvie Testud privilégie la comédie. En témoignent ses prestations dans Arrête ton cinéma !, Les Visiteurs - La Révolution, Tamara (et sa suite), Convoi exceptionnel, Toute ressemblance, Rendez-vous chez les Malawa, Champagne ! et Cocorico. Très active à la télévision, elle apparaît dans Eden de Dominik Moll, puis Peur sur le lac, Capitaine Marleau, Fugueuse et Ce que Pauline ne vous dit pas.