A la suite d'une audition, Eva Longoria obtient un petit rôle dans un épisode de la vénérable série Beverly Hills en 2000, sa première apparition télévisuelle !

Quelques temps après, elle figure au générique d'un autre classique de la télévision américaine : General Hospital. Mais son nom n'est pas créditée au générique. Il l'est enfin lorsqu'elle obtient le rôle d'Isabella Braña Williams dans le soap Les Feux de l'amour.

Un beau tremplin pour l'actrice puisque sa participation à cette véritable institution lui permet de produire et d'animer son propre show, "Hot Tamales, Live : Spicy, Hot and Hilarious", et d'obtenir un des rôles principaux dans la 2ème saison de la série remake Dragnet aux côtés d'Ed O'Neill. Malheureusement, la série n'est pas renouvelée.

Après une apparition dans le film Señorita Justice, sorti directement en vidéo, Eva Longoria obtient en 2004 le rôle de Gabrielle Solis dans Desperate Housewives. Véritable carton, la série la propulse du jour au lendemain au rang de vedette et de sex-symbol ! Les projets se multiplient et elle joue en 2005 aux côtés de Christian Bale dans Bad Times (2006) et de Kim Basinger et Michael Douglas dans The Sentinel (id.).

En 2008, elle obtient la tête d'affiche avec Le Fantôme de mon ex-fiancé aux côtés de Paul Rudd, puis incarne la même année une inspectrice de l'Education Nationale dans Desperate Teachers avec Jason Biggs.

2010 marque ses débuts à la réalisation avec Latinos Living the American Dream, documentaire sur la communauté latino aux Etats-Unis. Elle retourne à la réalisation en 2014 sur un épisode de la série Devious Maids créée par Marc Cherry (qu'elle a rencontré sur Desperate Housewives) et sur laquelle elle est également productrice déléguée.

Après l'arrêt de Desperate Housewives en 2012, Eva Longoria se lance dans le doublage puisqu'elle prête sa voix à l'un des personnages de la série d'animation Mother Up!. On la retrouve en 2014 à l'affiche du drame historique Cristeros aux côtés de Oscar Isaac, Andy Garcia et Santiago Cabrera.