Gwendoline Hamon naît le 27 août 1970 à Boulogne-Billancourt (Hauts-de-Seine). Son grand-père n’est autre que le célèbre écrivain et dramaturge Jean Anouilh. Avec ses parents et sa petite sœur, Julie, elle vit jusqu’à l’âge de huit ans à Dakar, au Sénégal. Lorsque ses parents divorcent, la jeune fille rentre en France avec sa mère. Grâce à sa grand-mère, Nicole Anouilh, Gwendoline Hamon développe une véritable passion pour l’art dramatique.

À l’âge de quatorze ans, elle commence à prendre des cours de théâtre puis fait véritablement ses débuts sur les planches quelques années plus tard. En 1990, à tout juste vingt ans, la jeune actrice donne la réplique à Michel Bouquet dans L’Avare de Molière.

Les années qui suivent sont l’occasion pour la comédienne de jouer plusieurs pièces de son illustre grand-père telles qu’Ornifle et le courant d’air, Roméo et Jeannette ou encore Le Bal des voleurs.

En parallèle de son activité au théâtre, Gwendoline Hamon commence également à se faire remarquer à la télévision grâce à des rôles dans plusieurs téléfilms (Les Noces de carton de Pierre Sisser – 1993 ; La dame aux camélias de Jean-Claude Brialy – 1998…) et séries (Les Cordier, juge et flic, Marc Eliot, Julie Lescaut…).

En 1999, elle interprète l’un des rôles importants de la série Evamag, aux côtés de Chantal Lauby et Tatiana Gousseff. Au cours des années 2000, Gwendoline Hamon se diversifie et tourne à plusieurs reprises pour le cinéma, devant la caméra de Diane Kurys (Sagan – 2008), Gérard Bitton et Michel Munz (Erreur de la banque en votre faveur – 2009) ou encore Cécile Telerman (Quelque chose à te dire – 2009).

Toujours très active à la télévision, l’actrice donne la réplique à son mari de l’époque, Frédéric Diefenthal, dans la série Flics. Le couple se retrouve également dans une autre fiction du petit écran, Les Virtuoses.

Mais c’est en 2015 que Gwendoline Hamon trouve certainement son rôle le plus populaire, celui de la commissaire Florence Cassandre dans la série Cassandre, diffusée sur France 3.

Tout en continuant à tourner dans la série, l’actrice s’illustre au cinéma devant la caméra de Guillaume Canet (Nous finirons ensemble – 2019) et Christian Carion (Une belle course – 2022). Au casting de plusieurs séries (Grand Hôtel – 2020 ; Une si longue nuit – 2021…), Gwendoline Hamon est en 2025 au casting de la fiction événement Rien ne t’efface, adapté du roman éponyme de Michel Bussi, aux côtés de Benjamin Baroche et Fauve Hautot.