Diplômée en français de l'Université du Kentucky, Ashley Judd étudie pendant de nombreuses années l'art dramatique. Elle débute sur les planches dans une version de Busted, montée par Naked Angels et mise en scène par Timothy Hutton, et décroche son premier rôle à la télévision dans la série Sisters. Elle fait également sa première apparition au cinéma aux côtés de Christian Slater dans Kuffs (1992) de Bruce A. Evans. Révélée au grand public dans le rôle-titre de Ruby in paradise de Victor Nunez, qui obtient le Grand Prix du Festival de Sundance 1993, Ashley Judd incarne Felicity, la fille d'Harvey Keitel dans Smoke (1995) de Wayne Wang.

Devenant une valeur montante d'Hollywood, elle a pour partenaires Robert De Niro (Heat, 1995) et Matthew McConaughey (Le Droit de tuer ?, 1996), qui seront également ses amants dans la vie. En 1997, Ashley Judd partage avec Morgan Freeman l'affiche du Collectionneur de Gary Fleder. Dès lors, elle s'impose dans des rôles physiques et se familiarise davantage avec le registre du thriller. Elle enchaîne Le Voyeur (1999) de Stephan Elliott avec Ewan McGregor et n'hésite pas à remplacer Jodie Foster dans le rôle de Libby Parsons pour les besoins de Double jeu (1999) de Bruce Beresford. Elle tourne à nouveau avec Morgan Freeman dans Crimes et pouvoir (2002) de Carl Franklin, un film à suspense dans lequel elle incarne un procureur ayant de sérieux doutes sur le passé de son mari, avant de se perdre dans les dédales tortueux d'Instincts meurtriers (2003).

Ashley Judd déploie également ses charmes dans la comédie romantique. Soutenant une jeune mère en la personne de Natalie Portman dans Où le coeur nous mène (2000), elle élabore une théorie sur le machisme dans Attraction animale (2001) de Tony Goldwyn. Trois ans plus tard, elle pousse la chansonnette aux côtés de Kevin Kline dans De-lovely (2004), une comédie musicale d'Irwin Winkler retraçant la vie du compositeur Cole Porter. Se faisant plus discrète sur les écrans, c'est sous la houlette de William Friedkin qu'elle revient sur le devant de la scène cinématographique avec Bug, un huis clos remarqué au Festival de Cannes 2006.

En 2010, elle croise Harrison Ford et Ray Liotta dans le film choral sur l'immigration, Droit de passage, puis s'essaye à la comédie pour enfants la même année avec Fée malgré lui, puis avec L' Incroyable histoire de Winter le dauphin en 2011. Dans ce dernier, qui est également son premier film en 3D, la comédienne retrouve Morgan Freeman, qu'elle avait déjà croisé dans un genre complètement différent, Le Collectionneur.