De nationalité britannique, Rhona Mitra étudie les arts dramatiques dans une école de théâtre fondée par l'actrice Judi Dench. Sa carrière d'actrice commence vers la fin des années 90 à la télévision, dans les séries The Bill et The Man Who Made Husbands Jealous. Elle est repérée par Eidos Interactive pour devenir l'avatar de l'héroïne Lara Croft pour la sortie du jeu vidéo Tomb Raider II en 1997. Elle sera pressentie pour interpréter le rôle sur grand écran. Au cinéma, Rhona Mitra débute par des seconds rôles ou des films mineurs. En 1999, on la retrouve aux côtés de Christophe Lambert dans Beowulf.

Le début des années 2000 semble plus propice à sa notoriété. Elle y côtoie Kevin Bacon dans le Hollow Man de Paul Verhoeven (2000), Sylvester Stallone dans Get Carter (2001) ou encore Jim Caviezel dans Highwaymen (2004). Rhona Mitra n'hésite pas non plus à s'engager dans des comédies comme Fashion victime et Ali G en 2002, alors que ses participations aux séries plus sérieuses Nip/Tuck et The Practice sont très apréciées du public. Elle poursuit sa carrière cinématographique en 2007 dans le film Shooter d'Antoine Fuqua et tente de percer le mystère du Nombre 23 dans le film éponyme de Joel Schumacher.

Pour ses premiers rôles, Rhona Mitra doit tenir tête à une horde de zombies dans l'explosif Doomsday de Neil Marshall (2008) et, tombant amoureuse d'un loup-garou, déclenche la guerre entre vampires et lycans dans Underworld 3 : Le Soulèvement des Lycans (2009).