Jonathan Mostow débute derrière la caméra alors qu'il est encore étudiant à la prestigieuse Harvard University. L'apprenti metteur en scène y tourne plusieurs courts métrages et documentaires remarqués. A la fin des années 1980, il réalise des productions à faible budget avant qu'il ne signe sa première réalisation avec le téléfilm Flight of the Black Angel pour le compte de la chaîne Showtime en 1991.

Mais ce n'est qu'en 1997 que Jonathan Mostow se révèle au grand public avec Breakdown, thriller tendu et original avec Kurt Russell dans le rôle principal. Mostow y tient également le rôle de scénariste. La même année, il assure la fonction de producteur exécutif pour le film de David Fincher, The Game. Pour les 30 ans du premier alunissage, il réalise "Le Voyage dans la Lune", dernier épisode de la série de fiction De la Terre à la lune, écrite et interprétée par Tom Hanks et célébrée aux Emmy Awards.

Courtisé par Hollywood, le metteur en scène consolide sa réputation de faiseur efficace avec le film d'action subaquatique U-571 avec Matthew McConaughey et Harvey Keitel en tête d'affiche. En 2003, il succède à James Cameron en dirigeant Arnold Schwarzenegger dans le troisième volet de la saga Terminator intitulé Le Soulèvement des machines. Malgré son succès satisfaisant au box-office, le film n'est pas à la hauteur des espérances et Jonathan Mostow préfère s'éloigner un temps de la réalisation.

En 2007, il revient à la série B fantastique en dirigeant pour la télévision le téléfilm Them (TV). mais Mostow garde cependant un pied à Hollywood avec le film Hancock de Peter Berg, pour lequel il tient le rôle de producteur exécutif. 2009 marque son retour à la mise en scène avec Clones. Adapté d'un comic book américain, son sujet d'une lutte de l'Homme contre la machine fait étrangement écho à son précédent film, Teminator 3.