Née d’une mère juge à la Cour Supérieure du Connecticut et d’un père avocat spécialisé dans le domaine de l’environnement, Amy Brenneman aurait pu se tourner elle aussi naturellement vers des études de droit. Elle a pourtant choisi une autre voie, celle l’étude des religions à l’université de Harvard. Au cours de son cursus, elle a passé un semestre entier au Népal pour apprendre des danses rituelles. Mais sa passion pour le théâtre entamée au lycée l’a vite rattrapée : elle a co-créé à Harvard la Cornerstone Theatre Company avec laquelle elle a tourné quelques années à travers les Etats-Unis après avoir avoir obtenu son diplôme.

Son premier rôle, elle l’obtient dans la série culte Arabesque en 1992 mais il s’agit alors quasiment de figuration. C’est dans New York Police Blues en 1993 qu’elle fait ses premiers pas dans un rôle principal, celui de l’officier Janice Licalsi qui a des liens avec la mafia. Présente uniquement dans la première saison et dans les premiers épisodes de la saison 2, elle a cotoyé le célèbre interpréte d’Horacio Caine, héros des Experts : Miami, alors connu en tant que détective John Kelly puisque leurs personnages développaient une histoire d’amour. La série, controversée, était en parfait accord avec l’état d’esprit de l’actrice qui a toujours tenu à montrer son engangement pour des causes difficiles, notamment le droit à l’avortement pour les femmes américaines. Elle déclarait alors y avoir eu recours et ne pas en avoir honte. Cette histoire personnelle inspirera quelques années plus tard les scénaristes d’une autre de ses séries…

Après son départ de New York Police Blues, le cinéma lui tend les bras. Elle enchaîne quelques blockbusters comme Heat de Michael Mann, Casper, Fear et Daylight entre 1994 et 1996. Elle se fera par la suite plus rare au cinéma, malgré des rôles dans Ce que je sais d'elle... d'un simple regard en 1999, 88 minutes en 2005 avec Al Pacino, Nine Lives en 2007, ou encore Mother & Child en 2010.

Après avoir été absente du petit-écran pendant 3 ans, elle fait son retour en 1998 dans la sitcom à succès Frasier dans un rôle récurrent le temps de 4 épisodes. En 1999, elle devient créatrice et productrice exécutive d’Amy, une série judiciaire dont elle s’offre le rôle-titre. Pour l’écrire, elle s’inspire de la vie de sa propre mère puisque l’héroïne n’est autre qu’une juge spécialisée dans les affaires de famille dans le Connecticut. Elle tient cependant à préciser à l’époque qu’elle ne joue pas le rôle de sa mère, mais simplement un personnage qui possède le même travail que sa mère mais pas sa vie. Pour preuve, Amy est mère célibataire, ce qui n’était pas le cas de la mère d’Amy Brenneman. Amy rencontrera un vif succès sur la chaîne CBS entre 1999 et 2005. Nominée à trois reprises pour ce rôle aux Emmy Awards, elle ne remporte jamais le prix. . Après 6 saisons et 138 épisodes, la série s’achève.

En 2007, elle est choisie pour incarner l’un des rôles principaux du très attendu spin-off de la série à succès Grey's Anatomy: Private Practice. Elle incarne le rôle du Dr. Violet Turner, psychiatre, une femme presque plus perturbée que ses patients.