Calista Flockhart débute sa carrière à l'université, où elle excelle déjà sur scène. Une passion qui lui vaut de se consacrer les années suivantes au théâtre. Elle joue dans bon nombre de pièces du répertoire classique : des Trois soeurs, de Tchekhov, à La ménagerie de verre, de Tennessee Williams, qui lui permet en 1994 de remporter deux prix parmi les plus importants décernés au théâtre. Acclamée par les critiques, l'actrice voit sa carrière prendre son envol. Courtisée par le cinéma, Robert Redford lui confie un petit rôle dans Quiz Show et elle enchaîne avec The Birdcage, aux côtés de Robin Williams et Gene Hackman.

En 1997, le producteur de séries David E. Kelley lui propose d'incarner Ally McBeal, une jeune avocate romantique mais névrosée dans la série éponyme. Après moult hésitations, la comédienne décide de se lancer dans cette aventure télévisuelle. Bien lui en a pris, le succès est immédiat et lui permet de s'affirmer au cinéma dans Le Songe d'une nuit d'ete et Ce que je sais d'elle... d'un simple regard.

À la suite de l'arrêt d'Ally McBeal, en 2002, Calista Flockhart met sa carrière d'actrice entre parenthèses pour s'occuper de sa famille.

Pour son retour à l'écran en 2005, elle change de registre en tournant dans Fragile, un film d'épouvante réalisé par Jaume Balaguero. L'année suivante, elle revient à la télévision dans la série d'ABC Brothers & Sisters. Elle y incarne la responsable de communication Kitty Walker tout au long des 5 saisons du programme. Après une apparition dans la Web Therapy de Lisa Kudrow, elle participe à la saison 2 de Full Circle créée par Neil LaBute. En 2015, la production de Supergirl l'engage pour prêter ses traits à Cat Grant, chef d'entreprise à la tête de l'entreprise médiatique qui embauche la jeune héroïne kryptonienne.