C'est en jouant la pièce MacBeth à l'âge de seize ans que Timothy Dalton se découvre une vocation de comédien. Dès lors, il étudie le théâtre au Royal Academy of Dramatic Art et rejoint ensuite le Birmingham Repertory Theater. En 1966, il fait sa première apparition télévisée dans la série Sat'day while sunday, où il côtoie le jeune Malcolm McDowell, et deux ans plus tard il se retrouve à donner la réplique à Peter O'Toole dans le médiéval Lion en hiver (1968).

Jugé trop jeune pour incarner James Bond dans Au service secret de sa Majesté (id.), il continue dans le film à costumes en jouant le prince Rupert dans Cromwell (1970) de Ken Hughes et le Lord Henry Darnley dans Marie Stuart (1971) de Charles Jarrott. Tout en travaillant l'œuvre théâtrale de William Shakespeare, Timothy Dalton se lance dans une carrière internationale, apparaissant dans El Hombre que supo amar (1978), drame historique espagnol se déroulant au temps de l'Inquisition, et dans la super production américaine Flash Gordon (1980).

Retrouvant à nouveau Vanessa Redgrave, sa partenaire dans Marie Stuart, pour les besoins du drame Agatha (1979), il se montre très actif à la télévision dans les années 80, enchaînant les séries Jane Eyre (1983) et L' Amour en héritage (1984). En 1987, il prend sa revanche sur le célèbre agent 007, endossant par deux fois son smoking dans Tuer n'est pas jouer (1987) et Permis de tuer (1989), tous deux réalisés par John Glen.

Malgré la popularité acquise grâce à ce rôle, l'acteur ne parvient pas à se hisser au rang de star et se contente de jouer dans des films au succès d'estime : La Putain du roi (1990), l'adaptation du roman de Jacques Tournier signée Alex Corti, The Rocketeer (1991), où il incarne un acteur pro-nazi, ou encore Naked in New York (1993) de Daniel Algrant. Après avoir interprété Rhett Butler dans la série télévisée Scarlett (1994) et l'empereur Jules César dans le téléfilm Cléopâtre (1999), Timothy Dalton fait son retour au cinéma en prenant les traits d'un shérif local aux prises avec des gangsters dans le polar Fausse donne (id.).

Quatre ans plus tard, il s'auto-parodie en agent secret, père de Brendan Fraser, dans Les Looney Tunes passent à l'action (2003), une comédie d'aventure de Joe Dante mêlant acteurs réels et personnages de dessin animé. En 2010, il adopte complètement le genre en prêtant sa voix à M. Labrosse dans le dernier volet des aventures de Toy Story 3.