Soeur cadette du comédien américain Michael Madsen.

Native de l'Illinois, Virginia Madsen est plongée dans la vie d'artiste dès l'enfance : sa mère, réalisatrice de documentaires, a été primée à l'Emmy Award. Après un rapide passage à la télévision, elle décide de se consacrer pleinement au cinéma et part s'installer en Californie. Trois mois après son arrivée, David Lynch la remarque et lui propose d'incarner la princesse Irulan dans Dune. Un rôle secondaire qui la lance dans le métier.

En 1987, elle tient le rôle principal du thriller érotique Slamdance, de Wayne Wang. L'année suivante, Danny Huston fait appel à elle pour Mr North et, enthousiasmé par la prestation de la comédienne, lui propose de travailler à nouveau avec lui pour Devenir Colette, en 1991. Sa popularité et son physique avantageux lui permettent de jouer dans des films grand public comme Highlander - Le retour aux côtés de Sean Connery et Christophe Lambert, The Hot Spot, de Dennis Hopper ou encore Candyman, un film d'horreur devenu culte dont elle est la vedette.

Bien que peu exposée médiatiquement, Virginia Madsen tourne à un rythme soutenu, se démarquant par l'éclectisme de ses choix. En 1998, elle rejoint le casting quatre étoiles (Matt Damon, Danny DeVito, Jon Voight) des Fantômes du passé, de Rob Reiner. Elle participe au film fantastique Hantise, le remake de La Maison du diable, de Robert Wise.

Sa carrière connaît un renouveau grâce au road-movie d'Alexander Payne, Sideways. Le rôle de Maya, sommelière séductrice, lui vaut en 2005 une nomination à l'Oscar du meilleur second rôle féminin. Elle revient alors sur le devant de la scène et se voit proposer de jouer dans des films prometteurs : The Last Show, comédie dramatique sur fond de musique country de Robert Altman, aux côtés de Meryl Streep, Kevin Kline et Tommy Lee Jones ou Firewall, thriller haletant pour lequel elle donne la réplique à Harrison Ford et à Paul Bettany. En 2007, elle est la femme de Jim Carrey dans l'inquiétant Nombre 23 puis tente de se faire une place sur le petit écran en jouant le premier rôle de la série Scoundrels en 2010. Malheureusement pour elle, la série ne rencontre pas le succès et est annulée au bout d'un an, c'est donc naturellement au cinéma qu'on la retrouve l'année suivante dans Le Chaperon Rouge dans lequel elle guide la jeune Amanda Seyfried.