Issu d'une famille d'acteurs - son père Walter a fait une belle carrière à la radio et sa mère Marcella était une actrice de théâtre - , Robert Vaughn se forme très jeune à l'art de comédie. Il fait ses débuts sur le petit écran, avant de se voir confier un petit rôle (non crédité) dans Les Dix Commandements. Mais le cinéma le découvre véritablement dans Ce monde à part, où il compose un jeune homme sombrant peu à peu dans l'alcoolisme sous les yeux impuissants de son ami, campé par Paul Newman. Sa prestation, marquée de l'empreinte de l'Actor's Studio, lui vaut une nomination à l'Oscar du Meilleur Second rôle. Nous sommes en 1959, et Vaughn est à la veille de connaître la consécration.

C'est avec Les 7 Mercenaires que l'acteur s'impose au niveau mondial. Devant la caméra de John Sturges, il est Lee, le tueur ganté de cuir ravagé par la culpabilité de ses crimes passés (le rôle sera repris par Ethan Hawke dans le remake sorti en 2016). La participation à la série d'espionnage Des agents très spéciaux, aux côtés de David McCallum, assoit encore sa renommée. Son flegme et son charme sobre font mouche, et le comédien devient un habitué du petit écran américain. A la fin des années 60, sa notoriété atteint son zénith lorsque Peter Yates l'oppose à Steve McQueen dans Bullitt. Manipulateur et arriviste à souhait, il contraste parfaitement avec le héros de ce polar-culte.

Les décennies suivantes verront Robert Vaughn se consacrer à la télévision. Il apparaît ainsi dans de nombreux unitaires de prestige, et régle les téléspectateurs par ses prestations dans Arabesque, L'Agence tous risques, Une nounou d'enfer ou encore Walter Texas Ranger. Démocrate engagé, il est un temps tenté par un destin politique pour contrer le Républicain (et acteur) Ronald Reagan. Robert Vaughn n'abandonne cependant pas le cinéma pour autant. On le retrouve ainsi, entre autres, au générique du all-star La Tour infernale, du désopilant S.O.B. et de Superman III, où il est le grand méchant mettant sa fortune au service de l'anéantissement du Man of Steel.