Né dans le Bronx à New York, Vincent Pastore grandit à New Rochelle au sein d'une famille d'origine italienne. Son père, John Pastore, travaille comme ouvrier dans une usine pour subvenir aux besoins du foyer. Après avoir obtenu son diplôme secondaire, le jeune homme s'engage d'abord comme marin dans la US Navy. Il poursuit ensuite ses études supérieures durant trois ans à l'Université Pace où il s'initie à l'art dramatique. Alors qu'il gère un club de nuit à New Rochelle, il est vivement encouragé à devenir comédien par les frères acteurs Matt et Kevin Dillon.

Avant d'embrasser pleinement la comédie à la quarantaine, Pastore passe près de trente ans dans l'univers de la nuit. Il effectue ses premiers pas sur les écrans à la fin des années 1980 dans des productions indépendantes. Sa carrure imposante et son timbre de voix caractéristiques le spécialisent rapidement dans les rôles de gangsters italo-américains. On l'aperçoit ainsi dans des classiques du film noir comme Les Affranchis de Martin Scorsese ou L'Impasse de Brian De Palma. En 1996, son rôle d'Angelo Ruggiero dans le téléfilm Gotti confirme son aisance naturelle dans l'univers de la mafia.

La consécration mondiale intervient en 1999 lorsqu'il rejoint le casting de la série événement d'HBO, Les Soprano. Il y prête ses traits à Salvatore « Big Pussy » Bonpensiero, un homme de main charismatique au destin tragique. Sa prestation poignante apporte une réelle profondeur humaine au personnage et lui vaut une immense popularité. Le succès colossal de la série impose durablement son visage dans le paysage audiovisuel américain. Cette interprétation marquante lui permet également de remporter un Screen Actors Guild Award avec l'ensemble du casting.

Après le chapitre des Soprano, l'acteur poursuit une carrière prolifique à la télévision (Paire de rois, Gravesend comme au cinéma (Mickey les yeux bleus, Revolver, Malavita, etc., ainsi qu'une multitude de DTV qu'il enchaîne avec un rythme impressionnant). Il diversifie son registre en prêtant notamment sa voix au requin Luca dans le film d'animation Gang de requins. En 2014, il monte sur les planches de Broadway pour jouer dans la comédie musicale Bullets Over Broadway. Il participe également à plusieurs émissions de télé-réalité tout en continuant de multiplier les apparitions télévisées.