Khandi Alexander débute par de nombreux petits rôles sur le petit et le grand écran. Après une apparition en 1993 aux côtés de Janet Jackson dans son Poetic Justice, elle joue la même année dans Tina, le film sur la vie de Tina Turner. Dix ans plus tard et quelques longs métrages à son actif, elle donne la réplique à Kurt Russell et Ving Rhames dans le thriller Dark Blue.

A la télévision, elle apparaît dans plusieurs séries : La Femme Nikita, Cosby, NYPD Blue, New York 911, New York Unité Spéciale. En 1995, elle intègre le casting de la sitcom NewsRadio. Mais son rôle le plus marquant est celui de Jackie, la soeur du Dr Benton dans Urgences. Anthony E. Zuiker lui propose en 2002 de rejoindre l'équipe des Experts : Miami dans le rôle du Dr Alexx Woods.