Catalina Sandino Moreno s'intéresse très tôt au théâtre et à la scène. En 1997, elle intègre l'Académie de Théâtre Ruben Di Pietro de Bogota, y jouant notamment les pièces La Chambre noire de Tennessee Williams ou Laughing wild de Christopher Durang. Au terme d'un vaste casting effectué en Colombie, elle est choisie pour tenir en 2004 le rôle principal de Maria, pleine de grâce, l'histoire d'une "mule" de trafiquants de drogues. Réalisé par l'Américain Joshua Marston, le film est un succès international primé à Sundance, Deauville et Berlin, où Catalina Sandino Moreno décroche le Prix d'Interprétation féminine.

Au succès fulgurant de ce premier film, succède une période difficile pour l'actrice qui se retrouve seule à New York, loin de sa famille, en Colombie, et avec peu d'argent. Bien qu'elle veuille éviter les rôles types de la belle latine, le réalisateur Ethan Hawke, séduit par sa beauté, lui propose d'incarner une talentueuse chanteuse new-yorkaise dans l'adaptation de son propre roman, The Hottest State. Deux ans après, ils se retrouvent tous les deux devant la caméra, pour Fast Food Nation dans lequel Catalina Sandino Moreno incarne une immigrée, travailleuse clandestine pour une usine de conditionnement de viande.

Elle retrouve ce même type de rôle dans l'oeuvre collective, Paris, Je T'aime, en 2005, pour "Loin du 16ème", sous la direction de Walter Salles et Daniela Thomas. En 2007, Mike Newell, réalisateur de Quatre mariages et un enterrement, lui offre un retour dans sa Colombie natale pour son premier film à costumes, L'Amour au temps du choléra. L'année suivante, l'actrice interprète une rebelle aux côtés de Benicio Del Toro dans Che - 1ère partie : L'Argentin et Che - 2ème partie : Guerilla (Che: Part Two - Guerrilla), deux films réalisés par Steven Soderbergh centrés sur la vie de Che Guevara. En 2010, Catalina Sandino Moreno change à nouveau de registre en rejoignant le casting de Twilight - Chapitre 3 : hésitation, le troisième épisode de la saga Twilight.