Né à Atlanta au sein d'un famille nombreuse, fils de jazzman, Spike Lee fait d'abord ses études au College Universitaire de Morehouse avant d'intégrer l'Ecole du Cinéma de New-York, dont il sort diplômé en production cinéma. Un des courts métrages qu'il y réalise lui permet de remporter, entre autres prix, l'Oscar du meilleur film étudiant : Joe's bed-study barbershop : we cut heads (1982), qui connaîtra une diffusion sur les ondes et pour lequel il fonde sa maison de production 40 Acres and a Mule.

Quatre ans plus tard, il réalise Nola Darling n'en fait qu'à sa tête, premier long métrage réalisé en douze jours avec une équipe réduite. Couronné par le prix de la jeunesse lors du Festival du Film de Cannes 1986, le film connaît un succès critique et public des deux côtés de l'Atlantique, et fait de son auteur le nouveau porte-parole du cinéma afro-américain. School Daze (1988), Do the right thing (1989), Mo' Better Blues (1990) – film musical qui reflète sa passion du jazz - et Jungle Fever (1991) viennent confirmer sa popularité, tandis que Malcolm X (1992), biographie du célèbre et controversé leader noir américain, provoque quelques réactions critiques.

Multipliant ses prises de position répétées contre la communauté WASP (White Anglo-Saxon Protestant), Spike Lee voit alors sa renommée quelque peu entamée. Il continue malgré tout à écrire et tourner ses propres sujets, essentiellement situés à Brooklyn, le quartier où il vit depuis son enfance, comme Crooklyn ou Clockers.

Aussi à l'aise dans le registre de la comédie en explorant l'univers des opératrices de téléphone rose dans Girl 6 (1996) que dans le drame avec Summer of Sam (1999), qui reprend pour toile de fond les meurtres perpétrés en été 1977 à New York. Il s'implique dans les hommages à la ville de New York suite aux attentats du 11 septembre, et tourne parallèlement plusieurs documentaires à succès comme 4 little girls ou The Original Kings of Comedy.

Spike Lee reprend la caméra en 2002 pour raconter la dernière journée d'un dealer avant son emprisonnement dans La 25e heure. Deux ans plus tard, il réalise She hate me une comédie de moeurs sur fond d'homosexualité et de scandale financier où l'on retrouve Anthony Mackie, Kerry Washington au côtés de Monica Bellucci et Jamel Debbouze.

Toujours proche des évènements qui touchent l'Amérique, il tourne pour la chaîne HBO un documentaire sur l'ouragan Katrina intitulé When the levee broke. En 2006 il revient en force avec Inside man - l'homme de l'intérieur, film de braquage à gros budget comptant au générique des pointures comme Denzel Washington, Clive Owen, Willem Dafoe ou Jodie Foster. 3 ans plus tard, il tournera un autre documentaire sur l'une de ses idoles de basket, Kobe Bryant des Los Angeles Lakers (bien qu'il soit un fan ardent des New York Knicks).

Entre-temps, il tourne 1 an plus tôt son 21ème long métrage, Miracle à Santa Anna. Adaptation du roman éponyme de James McBride, il évoque l'histoire d'un ancien soldat afro-américain qui aurait servi en Italie durant la Seconde Guerre Mondiale. Le film est un échec commercial et multiplie les controverses, lorsque l'Anpi (Association Nationale des Résistants d'Italie) dénonce des erreurs historiques dans le film. 

Après 2 nouveaux documentaires, (If God Is Willing and Da Creek Don't Rise en 2010 et Michael Jackson : Bad 25th anniversary en 2012 pour fêter l'anniversaire de l'album mythique d'MJ) Spike Lee tourne un nouveau long-métrage intitulé Red Hook Summer. Composé d'acteurs quasi-inconnus, le film est un nouvel échec pour lui. En Juillet 2011, Mandate Pictures contacte Spike, afin qu'il puisse relancer le projet avorté de Steven Spielberg de faire un remake du film coréen Old Boy. Ce dernier accepte. Avec Josh Brolin en personnage principal, le film sort en France le 1er Janvier 2014.

Si ses deux films suivants passent relativement inaperçus (Da Sweet Blood of Jesus et Chi-Raq), Spike Lee revient en force en 2018 avec la pertinente comédie policière BlacKkKlansman - J'ai infiltré le Ku Klux Klan qui reçoit le Grand Prix du Festival de Cannes. Après avoir signé pour Netflix Da 5 Bloods, centré sur quatre vétérans Afro-Américains du Viêt Nam qui retournent, de nos jours, dans ce pays, il est choisi pour être le président du jury du festival de Cannes de 2021.