Née en 1954 à Toronto (Canada), Catherine O’Hara passe une licence de théâtre et écrit pour la télévision. Elle s’installe à Chicago et prend part aux activités de la célèbre troupe d’improvisateurs "Second City", en faisant des imitations de Katharine Hepburn, Elizabeth Taylor et Brooke Shields lors d'un show qui remportera un grand succès auprès du public durant cinq années et lui vaudra un Emmy Awards. En parallèle, elle prête sa voix à un certain nombre de personnages de cartoons aux États-Unis.

L'actrice débute sa carrière cinématographique dans After Hours de Martin Scorsese avant d'être engagée pour jouer la mère évaporée de Macaulay Culkin dans le diptyque de Chris Columbus: Maman, j'ai raté l'avion, puis celle de Winona Ryder dans Beetlejuice de Tim Burton. Elle s'illustre ensuite dans Dick Tracy de Warren Beatty, film tiré de la bande dessinée éponyme, avant de rejoindre en 1986 le casting de La Brûlure de Mike Nichols. En 2002, elle poursuit dans le registre comique avec le rôle de la mère de Christina Applegate dans Famille à louer de Mike Mitchell et une participation aux Désastreuses aventures des orphelins Baudelaire de Brad Silberling, en compagnie de Jim Carrey.

Catherine O'Hara joue dans plusieurs « documenteurs » de Christopher Guest: Waiting for Guffman, A Mighty Wind, dont elle co-écrit certaines des chansons, et Bêtes de scène, pour lequel elle reçoit l'American Comedy Award. Elle retrouve le cinéaste et ses complices habituels en 2007 dans la comédie satirique For Your Consideration. En 2009, l'actrice canadienne apparait dans Away We Go de Sam Mendes avant de prêter sa voix au personnage de Judith dans Max et les maximonstres . Dans la comédie romantique Kiss & Kill, elle a pour partenaires les populaires Ashton Kutcher et Katherine Heigl.

A partir de 2015 et durant 80 épisodes, elle devient la maman de la famille Rose dans Schitt's Creek, remportant un Emmy de la Meilleur actrice dans une série comique.

Lorsque la série se termine en 2020, elle prête sa voix à divers longs métrages d'animation dont Le Robot sauvage, avant d'apparaître dans Argylle de Matthew Vaughn. Elle reprend ensuite son rôle de Delia dans la suite de Beetlejuice (2024), avant de jouer la psychologue d'une ville de survivants dans la deuxième saison de The Last of Us.

En 2025, elle était l'ancienne patronne du personnage interprété par Seth Rogen dans la série comique The Studio, satire de la vie des studios hollywoodiens.