Née en Caroline du Sud, Mary-Louise Parker passe son enfance à voyager, son père étant juge dans l’armée américaine. Après des études d’art dramatique, elle fait des débuts remarqués sur les planches dans une pièce de Craig Lucas, "Prelude to a Kiss", pour laquelle elle est nommée aux Tony Awards en 1990. Le metteur en scène la dirige également dans son film Un compagnon de longue date. Mais c'est l'année suivante que la comédienne décroche son premier véritable rôle au cinéma, aux côtés de Kathy Bates et Jessica Tandy dans Beignets de tomates vertes.

Tout en continuant de jouer au théâtre, Mary-Louise Parker enchaîne les tournages. Elle passe sans difficulté du thriller (Le Client) à la comédie dramatique (Avec ou sans hommes). En 2001, elle rejoint le casting d’A la Maison blanche. La comédienne marque les esprits en lobbyiste féministe, un rôle qu’elle endosse pour une vingtaine d’épisodes jusqu’à 2006. Parallèlement, elle est l'épouse d’Edward Norton confrontée à un tueur en série dans Dragon Rouge et participe à Angels in America, mini-série d’HBO où elle impressionne en femme mormone accro aux calmants.

En 2005, Mary-Louise Parker est choisie pour incarner Nancy Botwin dans Weeds. La série est encensée par la critique, et la comédienne remporte un Golden Globe pour son interprétation de mère célibataire vendant de la marijuana pour subvenir aux besoins de sa famille. Son succès à la télévision ne l’empêche pas de poursuivre au cinéma. Elle tourne dans différents genres, allant du western (L'Assassinat de Jesse James par le lâche Robert Ford) à la comédie d'action (Red, Red 2, R.I.P.D. Brigade Fantôme, Red Sparrow), en passant par le drame (Jamesy Boy, Golden Exits).

Parallèlement, la native de Fort Jackson apparaît dans les séries Blacklist, When We Rise, Billions et Mr. Mercedes.