C'est au lycée que Derek Jacobi découvre l'art dramatique au sein d'une petite troupe amateur, The Players of Leyton. Agé de 18 ans, il est jugé trop jeune pour entamer une carrière professionnelle et entre à Cambridge pour y entamer des études d'histoire.

Au cours de ses trois années à Cambridge, Derek Jacobi joue de nombreux rôles sur les planches, notamment celui d'Hamlet, qui lui valent une notoriété grandissante. Devenu membre de la Birmingham Rep, il est remarqué en 1963 par Laurence Olivier qui l'invite à devenir le huitième (et le plus jeune) membre fondateur du Nouveau Théâtre National de Grande-Bretagne. En 1971, il quitte la formation pour s'illustrer à la télévision : il devient le personnage principal de la minisérie Man of Straw (1972) puis de I, Claudius (1975). Sur petit écran, il incarne également à de multiples reprises les grands héros shakespeariens.

Dans les années 1980 et 1990, Derek Jacobi poursuit ses activités sur les planches (il entre à la prestigieuse Royal Shakespeare Company de 1982 à 1985) et sur le petit écran, mais commence également à se distinguer dans le domaine du septième art. Il y débute en 1965 dans Othello puis apparaît aux génériques de The Human Factor, Enigma. Il profite aussi de ces années pour former de nombreux acteurs dont Kenneth Branagh, acteur avec lequel il collaborera à plusieurs reprises, d'Henry V (1989) à Dead again (1991), en passant par Hamlet (1996) et Looking for Richard (1996).

En 2000, Derek est un sénateur romain dans le Gladiator de Ridley Scott, puis le valet de pied d'un aristocrate assassiné dans Gosford Park (2002). En 2006, il varie les plaisirs et confirme qu'il peut être bien plus qu'un acteur shakespearien, jouant coup sur coup dans le conte fantastique Nanny McPhee et le film d'action futuriste Underworld : evolution. Multipliant les prestations, il apparaît dans À la croisée des mondes : La Boussole d'or, Endgame, Le Discours d'un roi, Le Sang des Templiers, Cendrillon, Stratton, Le Crime de l'Orient-Express et reprend même son personnage dans Gladiator 2.

Également très actif côté petite lucarne, Derek Jacobi prend part aux séries The Borgias, Titanic : De sang et d'acier, Vicious, Last Tango in Halifax ou encore The Crown, dans laquelle il campe Édouard VIII. Le comédien anime aussi, en parallèle, plusieurs séries de podcasts, comme The War Master.