Après être apparue de manière récurrente dans la sitcom AB Productions Le Collège des coeurs brisés, Hélène de Fougerolles fait ses premières armes au cinéma sous la direction de Jean-Pierre Mocky. C'est en effet grâce à lui qu'elle joue dans Le Mari de Léon en 1993. Polyvalente, la comédienne participe aussi bien à des films grand public comme La Cité de la peur qu'à des films d'auteur tels que Jeanne la Pucelle, les prisons (1994) de Jacques Rivette et La Reine Margot (id.) de Patrice Chéreau.

La jeune génération de cinéastes s'intéresse également à elle : Cédric Klapisch la dirige dans Le Péril jeune et Chacun cherche son chat, et Mathieu Kassovitz dans Assassins en 1997. L'année suivante, Arthur Joffé lui offre le premier rôle principal de sa carrière dans Que la lumière soit !, tandis que Jean-Hugues Anglade lui donne à deux reprises la réplique dans Le Prof (1999) d'Alexandre Jardin et Mortel transfert (2001) de Jean-Jacques Beineix.

Reconnaissance de la profession : Hélène de Fougerolles reçoit en avril 2001 le Prix Romy Schneider qui récompense chaque année "une jeune comédienne dont le talent a été particulièrement remarqué".

Celle que l'on connaît désormais pour son naturel et sa fraîcheur s'essaie à une carrière internationale mais sans grand succès (The Fall d'Andrew Piddington, La Plage de Danny Boyle et The Sea de Baltasar Kormakur). Le grand public préfère la voir jouer de sa particule et incarner d'amusantes aristocrates dans la comédie d'aventure Le Raid (2002), le film d'ouverture du Festival de Cannes 2003 Fanfan la Tulipe, Les Aristos (2006) et la série Jeanne Poisson, Marquise de Pompadour (id.).

N'ayant pas peur du "ridicule" (Incontrôlable, Les Dents de la nuit), Hélène de Fougerolles se montre également à l'aise dans le registre romantique (Le Plus beau jour de ma vie et Tricheuse) et varie son jeu en s'illustrant dans l'inquiétant Innocence (2005) de Lucile Hadzihalilovic et le film de genre Mutants (2009) de David Morley.

Durant les années 2010, Hélène de Fougerolles privilégie le petit écran, comme en témoignent ses prestations dans des téléfilms appartenant à différents genres : la comédie romantique (Moi et ses ex, Trop jeune pour moi), le drame (Les Liens du Coeur), le policier (Meurtres à Strasbourg) ou encore le judiciaire (La Loi de Julien). La comédienne incarne également le capitaine Hélène Bach dans la série policière Balthazar aux côtés de Tomer Sisley, de 2018 à 2020.