D'origine cubaine, portoricaine et indienne, Rosario Dawson est repérée à l'âge de 16 ans par Larry Clark, sur le perron de la maison familiale. Séduit, le sulfureux cinéaste lui offre l'un des rôles principaux de son premier film, Kids, sombre description du quotidien de jeunes New-Yorkais qui fera scandale à sa sortie. Des débuts remarqués par Spike Lee notamment, qui la dirige dans son drame sportif He Got Game en 1998. Rosario Dawson multiplie alors les tournages, et joue la même année dans Side streets, avant d'enchaîner sur Light it up (1999), In love et King of the jungle en 2000.

2001 est une année charnière, puisqu'elle enchaîne de nombreux projets indépendants en quelques mois, de la comédie (Josie and the Pussycats, Rencontres à Manhattan d'Edward Burns) au drame (Chelsea Walls ou Ash wednesday, toujours de et avec Edward Burns), et attire l'attention des grands studios américains. Elle donne ainsi la réplique à Eddie Murphy dans la comédie de science-fiction Pluto Nash, avant d'affronter les aliens de MIIB aux côtés de Will Smith et Tommy Lee Jones. En 2002, elle retrouve Spike Lee pour La 25e heure, drame post-11 septembre où elle interprète la compagne d'Edward Norton.

Confirmant qu'elle fait partie des actrices dont la côte monte, elle apparaît en 2004 dans le peplum d'Oliver Stone, Alexandre, avant de venir compléter le casting pléthorique de l'adaptation du comic Sin City. Alors qu'elle tourne avec les plus grands réalisateurs dont Quentin Tarantino - avec qui elle joue dans Boulevard de la mort - elle travaille également avec des réalisateurs issus du cinéma indépendant tel Kevin Smith dans Clerks II (2006). En 2008, Rosario côtoie l'acteur montant Shia LaBeouf dans L'Oeil du mal et retrouve Will Smith avec lequel elle forme un couple dans Sept vies.

Elle participe en 2009 au doublage de The Haunted World of El Superbeasto réalisé par Rob Zombie avant de jouer le premier rôle principal féminin de Unstoppable de Tony Scott ainsi que le rôle de la déesse Persephone dans Percy Jackson le voleur de foudre de Chris Columbus. Rosario Dawson s'illustre ensuite en compagnie de Kevin James dans Zookeeper, une comédie où les animaux d'un zoo se mettent à parler le langage des hommes. Puis, elle interprète une psychologue qui suit James McAvoy aux côtés de Vincent Cassel dans l'envoutant Trance réalisé par Dany Boyle.

Egalement en 2014, la belle comédienne revêt l'ensemble en cuir de Gail pour Sin City : j'ai tué pour elle et est à l'affiche du nouveau film de Atom Egoyan, le thriller Captives. Un peu moins présente au cinéma, même si elle livre des prestations remarquées dans Rivales ou Krystal en 2017, la native de New York privilégie le petit écran et ses nombreuses séries. Parmi elles, les programmes Marvel Daredevil, Iron Fist, The Defenders et Luke Cage, dans la peau de l'infirmière Claire Temple, mais également Dopesick, où elle campe une enquêtrice déterminée rappelant son personnage de Captives.

Parallèlement, Rosario Dawson est très active dans le  domaine du doublage. Ainsi, elle prête son timbre à Wonder Woman (entre autres) dans Justice League: Throne of Atlantis, Justice League vs. Teen Titans, Justice League Dark, La Mort de Superman, Wonder Woman: Bloodlines, Reign of the Supermen et Justice League Dark: Apokolips War. En 2023, l'actrice tourne pour le réalisateur de Dear White People dans Le Manoir hanté, une comédie fantastique adaptée de la célèbre attraction des parcs Disney. Elle double la même année Catwoman dans la série podcast Batman: The Audio Adventures.