Timothy Olyphant suit des cours d'art dramatique et de théâtre en Californie avant de rejoindre l'atelier new-yorkais de William Esper, où il reçoit une récompense pour sa prestation dans la pièce The Monogamist (1995) de Christopher Kyle. Alors qu'il se distinguait dans le sport aquatique, il s'en détourne pour se consacrer à sa vocation d'acteur : il apparaît dans le pilote de la série Mr et Mrs Smith (1996) et dans un épisode de Sex & the City (1998). Il sera plus tard choisi pour faire régner la loi à Deadwood, où il incarne Seth Bullock pendant deux saisons (2004-2006).

Après quelques rôles secondaires, l'acteur décroche une belle première apparition sur grand écran en 1996 dans Le Club des ex aux côtés de Diane Keaton, puis une place plus visible dans Une vie moins ordinaire de Danny Boyle. Il obtient ensuite un rôle important dans Scream 2 (1997) de Wes Craven, où il marque les mémoires dans la peau de Mickey, le tueur en série fan de cinéma. Dealer de drogue dans Go (1999), il devient inspecteur dans 60 secondes chrono (2000), puis agent d'une actrice porno (Elisha Cuthbert) dans la comédie The Girl Next Door (2004).

Timothy Olyphant joue ensuite aux côtés de Jennifer Garner dans Ma vie sans lui avant de participer à Stop Loss, un film engagé sur le rejet de la guerre en Irak. Son rôle de méchant dans Die Hard 4 - retour en enfer le confronte à Bruce Willis; il reste du côté des gangsters avec Hitman, où il endosse la panoplie du tueur à gages dans l'adaptation du célèbre jeu vidéo produite par Luc Besson, avant de réenfiler son costume du shérif Seth Bullock pour les deux téléfilms de Deadwood, qui clôturent la série. L'acteur s'essaye de nouveau à la comédie avec l'histoire de braquage déjanté de High Life en 2008, aux côtés de Joe Anderson. Il retrouve l'acteur l'année suivante, dans le remake du film d'horreur de George A. Romero, The Crazies, dans lequel il endosse une nouvelle fois l'uniforme d'un shérif, cette fois-ci prêt à sauver sa ville d'une arme biologique.