Fille d'un journaliste Virginia Clarence Jones prend, dès l'âge de 6 ans, des cours de comédie à l'Ecole d'art dramatique de sa tante. Adolescente, elle participe à de nombreux spectacles et revues, notamment au sein de l'Opéra de Saint-Louis. La beauté de la jeune comédienne n'échappe pas à Samuel Goldwyn, qui lui fait signer un contrat en 1943. Cette année-là, elle obtient son premier petit rôle dans La vie aventureuse de Jack London (elle épousera d'ailleurs le héros du film, Michael O'Shea), avant d'apparaître dans de nombreuses comédies en Technicolor, aux côtés notamment de Danny Kaye (La Vie secrète de Walter Mitty).

En 1944, Virginia Mayo est la partenaire de Bob Hope dans La Princesse et le pirate, premier d'une longue série de films d'aventures, parmi lesquels La Flèche et le flambeau de Jacques Tourneur et Capitaine sans peur de Raoul Walsh avec Gregory Peck, tous deux en 1951. Deux ans plus tôt, Walsh avait offert à ce sex-symbol l'un de ses rôles les plus mémorables, celui de la petite amie de James Cagney dans L' Enfer est à lui. Virginia Mayo, qui aura été l'une des vedettes américaines les plus populaires dans les années 40 et 50 -le Sultan du Maroc aurait alors déclaré qu'elle était "la preuve tangible de l'existence de Dieu"- verra sa carrière décliner à partir de la décennie suivante, malgré quelques apparitions à la télévision (entre autre dans la série Dallas), et se consacrera alors à son autre passion : la peinture.