Natif du Canada, Nathan Fillion rêve très jeune de suivre les traces de ses parents et devenir enseignant. Le destin en décidera autrement ! Au cours de ses études à l’université locale, il attrape le virus de la comédie, en participant au Festival de théâtre de sa ville natale et à quelques spectacles. Le sort en est jeté, Nathan Fillion deviendra comédien. Le jeune homme prend alors son envol et met le cap vers les Etats-Unis dans l’espoir de faire carrière.

Son physique de jeune premier lui permet de décrocher en 1994 le rôle de Joey Buchanan dans le soap On ne vit qu'une fois. Son personnage devient vite très populaire auprès du public et sa prestation lui vaut une nomination aux Daytime Emmy Awards. Loin de dénigrer le feuilleton, l’acteur reviendra une dizaine d’années plus tard pour rendre hommage à la série de ses débuts à l’occasion du 10 000ème épisode. Le succès du soap ne lui ouvre cependant guère de perspectives. Nathan Fillion doit se contenter de quelques seconds rôles sur le petit et grand écran. Après une brève apparition dans la sitcom Spin City, il se perd dans l’enfer des combats d’Il faut sauver le soldat Ryan et est projeté dans Au-delà du réel, l'aventure continue.

Il obtient en 1998 un rôle récurrent dans la comédie Un toit pour trois, aux côtés de Traylor Howard et Ryan Reynolds. L’année suivante, il devient l'ex-petit ami d'Alicia Silverstone dans la comédie romantique Première sortie. Il endosse pour la première fois la soutane pour Dracula 2001, et remet ça avec Pasadena et surtout, Buffy contre les vampires. Son interprétation du prêtre Caleb, arrogant et misogyne, dans la série de Joss Whedon marque les esprits et donne à sa carrière le coup de pouce dont elle avait besoin.

Joss Whedon fait à nouveau appel à Nathan en 2002 quand il s’attaque à sa nouvelle série, Firefly. Il lui offre ainsi le rôle qui fait entrer le comédien dans la cours des grands : celui du commandant du Serenity, Malcolm Reynolds. Annulée faute d’audience suffisante à l’issue d’une courte première saison, Firefly est plébiscitée par un noyau de fans qui se mobilisent pour réclamer le retour du show. Sensible au soutien du public, la Fox met en chantier une suite, sous la forme du long métrage, Serenity : l'ultime rébellion, avec toujours Joss Whedon aux commandes. Une belle façon de clore le chapitre et élever Nathan Fillion au rang de star !

L’après-Firefly s’annonce malgré tout difficile… Le film indépendant Water's Edge et Outing Riley sortent directement en DVD. Nathan retrouve Alicia Silverstone dans la comédie Miss Match, malheureusement la série n’obtient pas le succès escompté et est déprogrammée avant même que son personnage n’apparaisse à l’écran. La Fox l’engage aussitôt dans le pilote de Hollywood Division, pour remplacer Matthew Settle. Manque de chance, la série ne voit finalement pas le jour. Horribilis, un film d'épouvante dans lequel il incarne un shérif qui tente de sauver sa ville des zombies, est boudé par le public. Sa participation en guest-star à un épisode de Lost, les disparus lors d’un flash-back concernant le personnage de Kate, ravit les fans. Le sort semble pourtant s’acharner. Le thriller fantastique La Voix des morts : la lumière ne sort même pas dans les salles américaines.

Nathan Fillion compte sur sa bonne étoile quand Tim Minear, le producteur exécutif d'Angel et Firefly, lui propose en 2007 de rejoindre l’aventure Drive. Lancée à la mi-saison sur la Fox, la série n’obtient pas les faveurs du public et est rapidement déprogrammée. Si l’émouvant Waitress redore le blason de l’acteur, c’est une fois encore la télévision qui lui permettra de s’élever. Nathan Fillion rejoint l’équipe de Desperate Housewives lors de la 4ème saison du show. Il y incarne le Dr Adam Mayfair, jeune époux de la nouvelle Desperate Housewives Katherine Mayfair, jouée par Dana Delany, son ancienne partenaire de Pasadena.

En 2008, Nathan Fillion se glisse dans la peau d’un super-méchant dans Doctor Horrible's Sing-Along Blog, une websérie musicale signée Joss Whedon. Une prestation hilarante qui démontre l’étendue de son talent ! Le comédien n’hésite pas à se tourner en dérision et renouveler l’expérience avec PG Porn. Conquise par le charisme du comédien, ABC lui offre le rôle principal de Castle, sa nouvelle série sur un auteur de polars à succès, qui intervient en tant que consultant auprès de la police new-yorkaise. Dès le lancement du show le 9 mars 2009, le public tombe sous le charme du duo qu’il compose avec Stana Katic, l’interprète du détective Beckett.

Multipliant les prestations avec un rythme frénétique, Nathan apparaît dans de nombreuses séries mis à part Castle (qui dure jusqu’en 2016), comme American Dad !, Community, Con Man, Santa Clarita Diet, Modern Family et Brooklyn Nine-Nine. Ses prestations vocales pour le petit et le grand écran sont elles aussi nombreuses (Monstres Academy, Cars 3, Deadpool et Wolverine, etc.). En 2018, il décroche un autre rôle crucial dans sa filmographie, celui de John Nolan, un quarantenaire qui décide de devenir policier, dans The Rookie. Côté cinéma, il campe en 2025 Green Lantern dans le nouveau Superman de James Gunn (qui l'avait fait tourner dans Super, The Suicide Squad et Les Gardiens de la Galaxie 3).