Durant son adolescence, Jason Segel est surtout connu pour ses talents de basketteur. Très vite, il devient un des joueurs émérites de l'équipe de son lycée et remporte avec ses partenaires le titre de Champion de Californie. Celui qui dribble aussi agilement qu'il joue du piano embrassera néanmoins un tout autre destin.

Ainsi Segel fait ses débuts au cinéma en 1999 en tenant des petits rôles dans des comédies pour adolescents comme Big party et Un cadavre sur le campus. La même année, il est révélé au public en campant le personnage de Nick Andopolis dans la série Freaks and Geeks, produite par Judd Apatow. Ce dernier l'engage à nouveau dans Les Années campus, une série qu'il crée en 2001 et qui ne dure qu'un an. Il obtient par la suite son premier rôle d'importance au cinéma dans la comédie Slackers (2002).

En 2004, Jason Segel est guest-star dans deux séries à succès, Alias et Les Experts puis s'essaye à un nouveau registre avec le film 11 : 14 onze heures quatorze où il côtoie Hilary Swank et Patrick Swayze. L'année suivante, Carter Bays et Craig Thomas offrent au comédien un rôle en or. Grands fans de Freaks and Geeks, les créateurs de la série How I Met Your Mother lui proposent le rôle de Marshall Eriksen, étudiant en droit à la fois maladroit et touchant. Il accepte et, entouré de Josh Radnor, Neil Patrick Harris, Cobie Smulders et Alyson Hannigan, obtient la consécration.

Jason Segel ne délaisse pourtant pas le cinéma et continue sa fructueuse collaboration avec Judd Apatow. Il tient ainsi un rôle secondaire dans En cloque, mode d'emploi (2007) et sa suite This Is 40 (2012), puis Apatow produit Sans Sarah rien ne va ! (2008), premier film dont Segel signe le scénario. Le comédien tient également le rôle principal de cette comédie romantique pas comme les autres où il donne la réplique à Kristen Bell. Les deux hommes produisent ensuite American Trip (2010), "spin-off" de Sans Sarah rien ne va !. Ces deux films sont réalisés par Nicholas Stoller qui met également en scène, en 2012, 5 ans de réflexion. Un film qui compte parmi ses producteurs Judd Apatow et qui est de nouveau écrit par Jason Segel, également acteur principal aux côtés d'Emily Blunt (sa co-star dans Les Voyages de Gulliver, 2011).

Jason Segel prend tout de même part à des projets qui ne sont pas rattachés à son ami producteur. Ainsi, après avoir été le meilleur ami de Paul Rudd dans I Love You, Man (2009), il donne de la voix pour le film d'animation Moi, moche et méchant (2010) et est un collègue cool de Cameron Diaz dans l'hilarant Bad Teacher (2011). Il se lance aussi dans un projet plus personnel, faire renaître les Muppets au cinéma. Il écrit donc, avec son fidèle partenaire Nicholas Stoller, Les Muppets, le retour. Ce film, que les deux hommes produisent et dont Segel partage l'affiche, sort en France directement en DVD en 2012.