Issue d'une famille d'immigrés italiens du Bronx, Anne Bancroft, de son vrai nom Anna-Maria Louisa Italiano, se dirige vers une carrière de laborantine, mais ses parents, et en particulier sa mère, l'orientent vers l'art dramatique. Elle est vite remarquée par un producteur de télévision, Worthington Minor, et tourne dès 1949 les séries Suspense et The Adventures of Ellery Queen. En 1952, elle se rend à Hollywood afin d'y tenter sa chance en tant que comédienne.

Ayant signé un contrat d'exclusivité de deux ans avec la 20th Century Fox, elle débute devant la caméra de Roy Ward Baker en apparaissant dans Troublez-moi ce soir aux côtés de deux stars : Marilyn Monroe et Richard Widmark. Elle joue ensuite dans des films d'aventure tels que Les Gladiateurs (1954) avec Victor Mature. Elle retrouve d'ailleurs ce dernier dans La Charge des tuniques bleues (1955) d'Anthony Mann, puis participe à Nightfall (1956) de Jacques Tourneur.

Exténuée par la vie hollywoodienne, elle revient à New York pour goûter aux planches de Broadway. Sa route croise celle d'Arthur Penn qui la dirige dans plusieurs pièces dont Deux sur la balançoire et Miracle en Alabama. Le succès de cette oeuvre est tel qu'elle devient un film réalisé par Penn et toujours interprété par Anne Bancroft. Celle-ci remporte un Oscar pour sa performance et peut enfin conquérir Hollywood. Elle se distingue à nouveau en 1964 avec Le Mangeur de citrouilles de Jack Clayton, qui lui vaut une nomination à l'Oscar de la Meilleure actrice. En 1966, elle rejoint John Ford dans un rôle de femme forte sur le dernier film du maître, Frontière chinoise, puis interprète son personnage le plus célèbre, celui de Mrs Robinson, qui charmera le jeune Dustin Hoffman dans Le Lauréat (1967) de Mike Nichols.

Epouse du réalisateur et comédien Mel Brooks depuis 1964, Anne Bancroft partage plusieurs fois l'affiche avec lui. On les retrouve ainsi dans Le Shérif est en prison (1974), La Dernière folie de Mel Brooks (1976), To be or not to be (1983) et plus tard dans Dracula, mort et heureux de l'être (1995). Ne tournant qu'avec parcimonie, Anne Bancroft s'illustre toujours par la qualité de ses choix. A l'affiche du Prisonnier de la seconde avenue de Melvin Frank en 1974, elle est à nouveau nommée à l'Oscar de la Meilleure Actrice en 1978 pour Le Tournant de la vie de Herbert Ross et en 1986 pour Agnès de Dieu de Norman Jewison.

En 1996, elle prête sa voix au film d'animation Fourmiz, puis incarne face à Demi Moore une ambitieuse sénatrice luttant contre le sexisme dans l'armée américaine pour les besoins de A armes égales (1997). Parmi ces derniers rôles figure celui de la mère juive de Ben Stiller dans la comédie Au nom d'Anna (2000) d'Edward Norton.