Fils du comédien de théâtre Alan Miller et petit-fils de Bernard Lee qui incarna M dans de nombreux James Bond.

Acteur professionnel depuis l'âge de onze ans, Jonny Lee Miller fait ses véritables débuts au cinéma avec Hackers (1995), un thriller dans lequel il interprète un cyberpunk face à Angelina Jolie. Leur rencontre sur le plateau de tournage débouchera sur un mariage qui prendra fin en 1999. La consécration arrive en 1996 avec le rôle du junkie Sick Boy dans le culte Trainspotting de Danny Boyle.

Suivent la comédie dramatique L'Amour, et après (1998), le film d'aventure Guns 1748 (1999), où il retrouve Robert Carlyle, l'un de ses partenaires de jeu dans Trainspotting, et le polar déjanté Gangsters, sex & karaoké (2000), l'occasion pour Jonny Lee Miller de donner la réplique à Jude Law, son associé dans la société de production Natural Nylon.

Tentant une carrière hollywoodienne, il se retouve à chasser les vampires dans Dracula 2001 (2001), remplace au pied levé Gerard Butler au casting du thriller d'action Profession profiler (2002) de Renny Harlin, joue les seconds rôles chez Woody Allen dans Melinda et Melinda, donne la réplique à Charlize Theron dans Aeon Flux... Malheureusement, tous ces choix se soldent par des échecs critiques et commerciaux qui empêchent l'acteur de gagner en visibilité. C'est la télévision qui semble alors offrir à Jonny Lee Miller les meilleures opportunités ; il décroche le rôle-titre de la série judiciaire Eli Stone le temps de deux saisons, avant de tourner pour la BBC dans Emma. On le retrouve même dans la peau du glaçant Jordan Chase dans la saison 5 de Dexter, face à Michael C. Hall et Jennifer Carpenter.

Après avoir retrouvé Danny Boyle le temps d'une performance théâtrale exceptionnelle retransmise au cinéma avec Benedict Cumberbatch, Jonny Lee Miller tourne pour Tim Burton dans le loufoque Dark Shadows. C'est une nouvelle fois la télévision qui lui permet de renouer avec le succès : il incarne depuis cinq saisons une version moderne de Sherlock Holmes dans Elementary aux côtés de Lucy Liu, loin du rôle de son compagnon de théâtre pour la BBC. Son retour au cinéma est marqué par la suite très attendue des aventures du quatuor fou de Trainspotting, toujours réalisée par Danny Boyle, vingt ans après le premier film.