Fille de l'acteur-réalisateur Mark Miller et de la journaliste Bea Ammidown, Penelope Ann Miller arrête ses études à dix-huit ans pour suivre des cours de danse, d'élocution et d'art dramatique dans l'atelier new-yorkais d'Herbert Berghof. De retour sur la côte ouest, elle apparaît dans Hotshot (1987) et interprète Daisy dans la comédie de Neil Simon, Biloxi blues, rôle qu'elle reprend quelques mois plus tard à New York, puis à l'écran, sous la direction de Mike Nichols et face à Matthew Broderick.

Découverte par le grand public dans Nuit de folie (1987), le premier long métrage de Chris Columbus, où elle incarne une jeune fugueuse hystérique, Penelope Ann Miller interprète tour à tour la fiancée de Pee Wee Herman dans Big top Pee-wee (1988), la compagne de Don Johnson dans Dead bang (1989), la fille de Marlon Brando dans Premiers pas dans la mafia (1990) ou encore l'égérie d'Arnold Schwarzenegger dans Un flic à la maternelle (id.).

Autres rôles marquants : cette actrice raffinée mais discrète se glisse dans la peau de Paula, une jeune femme qui redonne goût à la vie à Robert De Niro dans L'Eveil (1990), puis montre ses talents de danseuse et vit une romance passionnée avec Al Pacino dans L'Impasse (1993). Dans un registre différent, elle prête main forte à Tom Sizemore dans la lutte contre une horrible créature dans Relic (1997).

A partir de 1997, ses apparitions au cinéma se font plus rares. En 2001, Penelope Ann Miller retrouve le chemin des studios en interprétant une mère éplorée dans Le Masque de l'araignée et en donnant la réplique à Patrick Swayze et Melanie Griffith dans le drame sentimental Forever Lulu. S'illustrant par la suite dans des téléfilms et séries comme Desperate Housewives, elle plonge en 2006 dans l'univers horrifique des frères Pang pour Les Messagers.