Né à Edinbourg, Iain Alan Sutherland Glen est le plus jeune des trois fils d’Hamish Glen, directeur général d’une société d’investissement écossaise. Après une scolarité difficile à l’Edinburgh Academy, Iain, tout comme son frère aîné, se dirige vers une carrière théâtrale. Il étudie à l’Aberdeen University, où il joue dans plusieurs productions, et découvre ainsi sa voie. Après une prestation acclamée dans Bent, une pièce de Martin Sherman qui traite de la culture gay dans l’Allemagne nazie, le jeune homme quitte l’école. Il joue alors dans If One Green Bottle, pièce écrite par un de ses anciens camarades de classe et mise en scène par son propre frère. Le spectacle sert d’audition à l’apprenti acteur, qui intègre ainsi la Royal Academy of Dramatic Art de Londres. Il en sort diplômé en 1985, avec la médaille Bancroft remise chaque année à l’étudiant le plus prometteur.

Après plusieurs petits rôles dans différentes productions théâtrales, Iain éblouit les critiques en 1988 grâce à son interprétation de Carl Galon, un chef mafieux, dans la mini-série The Fear. Ce rôle le place très vite sur le radar d’Hollywood, puisque la même année, il apparaît aux côtés de Sigourney Weaver dans Gorilles dans la brume, biopic consacré à la scientifique Diane Fossey, puis dans Paris by Night, avec Charlotte Rampling et Michael Gambon. En 1990, il obtient l’un des rôles principaux d'Aux sources du Nil. Il est Hamlet dans la comédie Rosencrantz & Guildenstern sont morts, avec Tim Roth et Gary Oldman, puis le meurtrier écossais Larry Winters dans Silent Scream, et enfin un jeune Irlandais dans Fools of Fortune. Iain Glen reçoit alors le British Film Awards du Meilleur Acteur, récompensant son important travail cinématographique tout au long de cette année. En 1992, Glen obtient le rôle-titre d’Adam Bede, l’adaptation télévisée du roman du même nom écrit par George Eliot. Durant le tournage, il rencontre l’actrice Susannah Harker, qu’il épouse par la suite.

Iain Glen poursuit en parallèle sa carrière sur les planches, et interprète les rôles principaux de plusieurs pièces de William Shakespeare. En 1991, il est Hamlet. Un an plus tard, il affronte Kenneth Branagh dans Corialanus. Il joue ensuite dans Le Roi Lear, MacBeth et Les Chroniques de l’Histoire d’Henry V. Chacune de ses prestations vaut à l’acteur de nombreuses critiques élogieuses. Lors des Laurence Olivier Awards de 1997, l’équivalent britannique des Molières français, Iain Glen est nommé en tant que Meilleur Acteur dans une Comédie Musicale pour son rôle dans Martin Guerre, un spectacle de Cameron Mackintosh, créateur de la version musicale des Misérables. 1998 marque ses débuts à Broadway, dans la pièce The Blue Room, écrite par David Hare et mise en scène par Sam Mendes, dans laquelle Glen et sa partenaire Nicole Kidman jouent chacun cinq personnages différents.

En 2001, il apparaît dans l’adaptation cinématographique du jeu vidéo culte Tomb Raider. Il y interprète Manfred Powell,  l’adversaire de la belle archéologue Lara Croft, à laquelle Angelina Jolie prête ses traits. Iain Glen se spécialise alors dans les rôles d’antagonistes. Il terrifie Lena Olin et Anna Paquin dans Darkness en 2002, joue un prêtre sadique l’année suivante dans Song for a Raggy Boy, puis un scientifique diabolique dans Resident Evil : Apocalypse en 2004 (un personnage qu’il reprend trois ans plus tard dans Resident Evil : Extinction), et un romain arrogant dans La Dernière Légion en 2007.

Simultanément à ses prestations sur grand écran et sur les planches, Iain Glen apparaît dans plusieurs séries et mini-séries britanniques. En 2008, il est Otto Frank dans Le Journal d'Anne Frank, une production de la BBC. La jeune juive est interprétée par Ellie Kendrick, qu’il croisera plus tard dans les coulisses de Game of Thrones. L’année suivante, l’acteur rejoint la distribution de la neuvième saison de [MI-5]. Puis, dans Downton Abbey, il est Sir Richard Carlisle, un magnat de la presse qui fait chanter Lady Mary (Michelle Dockery)  pour la forcer à l’épouser. Il incarne ensuite le détective privé Jack Taylor, dans la série irlandaise éponyme. Au cinéma, dans le biopic consacré à Margaret Thatcher, La dame de fer, il interprète Alfred Roberts, le père de l’ancienne Premier Ministre, incarnée par Meryl Streep.

La même année, il est un des premiers acteurs à intégrer la distribution de Game of Thrones. Iain Glen y joue Jorah Mormont, un chevalier exilé de sa terre natale qui se met au service, et tombe peu à peu amoureux, de Daenerys Targaryen (Emilia Clarke). En 2012, il fait partie du casting de Prisoners’ Wives, série de la BBC One centrée que le quotidien de femmes dont le seul point commun est d’avoir leurs compagnons respectifs emprisonnés au même endroit. Il rejoint Breathless en 2013, une série britannique située dans le Londres des années 1960, et qui suit  le quotidien de gynécologues qui vont devoir faire face à l'émergence de la "révolution sexuelle".

Anne-Laure Tricot