Stéphane De Groodt naît à Bruxelles d'une mère femme au foyer et d'un père ingénieur. Il connaît une scolarité difficile en raison de sa dyslexie mais ne tarde pas à faire preuve de talent au théâtre. Parallèlement, il nourrit le rêve de devenir pilote de course. Il décide donc d'abandonner sa scolarité tôt et vivre de ses passions, tout en effectuant plusieurs petits boulots. Le jeune homme devient alors pilote professionnel et décroche notamment le titre de Champion de Belgique en BMW Compact Cup. Il décide cependant d'arrêter sa carrière en 2000 pour se consacrer à la comédie.

Cette même année, Stéphane De Groodt rencontre sa compagne, l'écrivain et scénariste Odile d'Oultremont, avec qui il créé la série File dans ta chambre, diffusée à partir du 14 janvier 2002 sur Canal+ Belgique, puis sur la RTBF et France 2. Il prête aussi sa voix pour des personnages animés de la série Une minute avant ou encore dans des publicités.

Stéphane De Groodt trouve son premier rôle au cinéma dans la comédie dramatique Mauvais Genres de Francis Girod. Il enchaîne avec plusieurs petits rôles dans des films aussi différents que 3 petites filles, Alive, Casablanca Driver, Pour le plaisir ou encore Saint-Jacques… La Mecque. En 2008, il est Numéric dans Astérix aux Jeux olympiques de Thomas Langmann. Le comédien poursuit avec des prestations sensiblement plus conséquentes dans Baby blues, Une chaîne pour deux et Sans laisser de traces. En 2012, il fait partie de la distribution de Astérix et Obélix : Au service de Sa Majesté de Laurent Tirard (il joue le décurion du stade).

Sa notoriété grandissant, Stéphane De Groodt obtient le troisième rôle principal dans Chez nous c'est trois !, une comédie franco-belge réalisée par Claude Duty. Il poursuit en incarnant l'avocat du personnage de Dany Boon dans la très lucrative comédie Supercondriaque. Privilégiant la comédie, l'acteur est à l'affiche des Gazelles, My Old Lady et Une heure de tranquillité. En 2015, il campe le père de la famille recomposée au centre du road movie Paris-Willouby. Dans le percutant Corporate, il joue un collègue du personnage tenu par Céline Salette.

En 2017, Stéphane De Groodt porte le film L'Un dans l'autre en compagnie de Louise Bourgoin. Dans cette comédie fantastique signée Bruno Chiche, les deux comédiens incarnent respectivement les personnages de Pierre et Pénélope, des amants se réveillant un matin dans le corps de l'autre. L'année suivante, il campe l'un des huit invités du Jeu de Fred Cavayé, où des couples d’amis décident de jouer à un « jeu » le temps d'une soirée, dans lequel chacun doit poser son téléphone portable au milieu de la table et chaque SMS, appel téléphonique, mail et autres message Facebook doivent être partagés avec les autres.