Diplômée en science politique et se destinant à une carrière juridique, Maria Bello se consacre finalement au théâtre en se produisant dans des pièces comme The Killer Inside Me, Smart Town Gals ou encore Big Problems. Elle se voit proposer un rôle régulier à la télévision dans la série d'espionnage Mr. et Mrs. Smith (1996), aux côtés de Scott Bakula, puis devient la pédiatre passionnée Anna Del Amico dans le très populaire feuilleton Urgences (1997-1998), personnage pour lequel elle remporte un Screen Actors Guild Award.

Après avoir côtoyé Ben Stiller et Elizabeth Hurley dans le drame Permanent Midnight (1998) de David Veloz, Maria Bello interprète une prostituée, partenaire de Mel Gibson, dans le polar Payback (1999). L'année suivante, elle tourne un documentaire au format Imax intitulé Expédition panda en Chine. Son physique avantageux et sa fraîcheur lui permettent d'incarner tour à tour un manager de bar dans Coyote Girls (2000), une chanteuse de karaoké dans Duos d'un jour (2001) ou encore une comédienne de la série Papa Schultz dans Auto focus (2003) de Paul Schrader.

Tentée par le thriller, Maria Bello campe l'ex-épouse de Johnny Depp dans Fenêtre secrète (2004), l'adaptation d'une nouvelle de Stephen King, devient l'atout charme de Assaut sur le central 13 (2005), se fait diriger par David Cronenberg dans A History Of Violence (id.) et cède au Chantage de Pierce Brosnan en 2008. Egalement au casting du World Trade Center (2006) d'Oliver Stone, elle renoue avec l'action pour La Momie 3 : la tombe de l'empereur dragon (2008). Épouse de Kevin James dans la comédie Copains pour toujours, l'actrice continue de collaborer avec des partenaires de prestige tout en multipliant les genres puisqu'elle tourne dans le drame The Company Men (2011) en compagnie des vétérans Kevin Costner et Tommy Lee Jones avant de donner la réplique à la star montante Taylor Lautner dans le thriller Abduction (2012).