Guillaume Depardieu est le fils des comédiens Gérard Depardieu et Elisabeth Depardieu.

Il se familiarise dès l'enfance avec le milieu du cinéma. Son père l'emmène parfois sur les plateaux de tournage : il est ainsi figurant dans Pas si méchant que ça (1974), Jean de Florette (1986) ou encore Cyrano de Bergerac (1990).

Mais c'est à Alain Corneau qu'il doit son premier grand rôle avec Tous les matins du monde (1991). Il y incarne Marin Marais jeune alors que son père tient le rôle de Marais adulte. En 1993, le cinéaste et ami Pierre Salvadori lui propose d'interpréter un tueur à gages formé par Jean Rochefort dans Cible émouvante. Leur fructueuse collaboration se poursuit avec les comédies Les Apprentis (1995) et Comme elle respire (1997). Sa prestation de Fred, le colocataire et ami glandeur de François Cluzet dans Les Apprentis, lui permet de remporter en 1996 le César du Meilleur espoir masculin.

Dès lors, ce grand blond à la fois drôle, rebelle et rêveur emprunte le chemin du succès. Directeur d'une agence matrimoniale dans Alliance cherche doigt (1997) de Jean-Pierre Mocky, il incarne un soldat amoureux de Clotilde Courau dans Marthe (id.) de Jean-Loup Hubert. Malgré des problèmes de drogue, Guillaume Depardieu se rend à Cannes pour présenter en 1999 Pola X de Leos Carax, où il incarne le fils de Catherine Deneuve.

S'étant assagi, cet écorché vif est à l'affiche de trois films en 2002 : Comme un avion de Marie-France Pisier, Peau d'ange de Vincent Perez et Aime ton père, un drame de Jacob Berger dans lequel il donne la réplique à son propre père. Ce dernier film multiplie les analogies avec la réalité. Guillaume Depardieu y joue un personnage dont le passé est quasiment identique au sien et qui cherche à régler ses comptes avec son père une bonne fois pour toutes.

En 2003, il retrouve Vincent Perez dans Le Pharmacien de garde de Jean Veber avant de rejoindre Béatrice Dalle, l'année suivante, sur le tournage de Process de C.S. Leigh.

En 2005, Guillaume Depardieu passe du grand au petit écran, puisqu'il incarne Louis le Hutin dans la série télévisée Les Rois Maudits où il joue, une nouvelle fois, aux côtés de son père et de sa soeur, Julie Depardieu. Il avait déjà fait une apparition dans la version télévisée de Napoléon avec Christian Clavier. Mais l'acteur retrouve bien vite le grand écran, puisqu'en 2006, il tient le rôle principal dans la comédie de Jean-Michel Verner, Célibataires, avant d'incarner, en 2007, Armand de Montriveau, un général français repoussé par sa bien-aimée, dans le drame de Jacques Rivette, Ne touchez pas la hache.

2007 semble être l'année des drames pour l'acteur puisqu'il rejoint Sylvie Testud et Pascal Greggory dans La France de Serge Bozon, un film dont l'action se situe pendant la première guerre mondiale; avant de tourner dans le second film de Thomas Lilti, Les Yeux bandés, où il incarne un homme accusé de meurtre.

Foudroyé par une pneumonie, Guillaume Depardieu décède le 13 octobre 2008 à l'hôpital de Garches. Sa mort intervient quelques jours après la fin du tournage de L' Enfance d'Icare, film entrant en résonance avec son propre vie (notamment avec son amputation d'une jambe). Il est nommé à titre posthume au César du meilleur acteur pour son rôle dans Versailles, celui d'un marginal qui recueille un enfant abandonné. Le regretté comédien apparaîtra également dans trois films réalisés peu de temps avant son décès: Stella où il joue aux côtés du chanteur Benjamin Biolay, Les Inséparables où il interprète un personnage qui tente de vaincre son addiction à la drogue, et Au voleur, dans lequel il campe un cambrioleur pourchassé par les forces de l'ordre.