Matthew Fox commence sa carrière au petit écran avec l'éphémère série Freshman Dorm, annulée par la chaîne CBS au bout de cinq épisodes. Après un second rôle dans le film My Boyfriend's Back, il intègre la distribution de la série La Vie à cinq en 1994. Durant six saisons, son rôle de Charlie, le grand frère protecteur, permet au grand public de le découvrir.

Deux ans après la série fantastique Haunted, interrompue après seulement onze épisodes, la carrière de Matthew Fox bascule. En 2004, il est choisi par J.J. Abrams (Alias) pour tenir le rôle principal de sa nouvelle création, Lost, les disparus. C'est la consécration pour l'acteur : la série est un véritable phénomène et son rôle du survivant Jack Shephard lui permet notamment d'obtenir un Golden Satellite Award.

Le succès planétaire de Lost, les disparus permet à Matthew Fox d'élargir pour de bon son horizon professionnel au cinéma. Après avoir partagé l'affiche de We Are Marshall avec Matthew McConaughey et participé à l'explosif Mi$e à prix de Joe Carnahan, il franchit un palier en 2008 en s'illustrant dans le thriller Angles d'attaque et en incarnant Racer X dans Speed Racer, adaptation de la célèbre série animée de Tatsuo Yoshida réalisée par Andy et Larry Wachowski.