Samuel Labarthe entre au Conservatoire National Supérieur d'Art Dramatique de Paris en 1983 où il suit les cours de Viviane Theophilides, Michel Bouquet et Daniel Mesguich. D'emblée il décroche des rôles au théâtre et alterne oeuvres classiques, Racine, Corneille, Edmond Rostand, Pirandello, Tchekhov et oeuvres plus contemporaines, Moravia, Pasolini, Calvino, Marguerite Duras, Arthur Miller. Côté metteurs en scène, il collabore avec Francoise Seigner, Gerard Desarthe pour Le Cid ou encore Jérôme Savary.

Sa carrière cinématographique met plus de temps à décoller malgré un beau rôle dans Mangeclous de Moshe Mizrahi (1988) aux côtés de Pierre Richard. Au rythme d'un film par an, il tourne sous la direction de Francis Girod dans Lacenaire (1990) où il interprète l'Abbé de Lusignan avant de rejoindre Jean Poiret pour la comédie Le Zèbre (1991) puis Claude Miller en tant qu'amant de Elena Safonova dans L' Accompagnatrice (1992). Deux ans plus tard, l'acteur campe un voleur à la tire dans Aux petits bonheurs de Michel Deville, avant de jouer la carte de l'originalité en prêtant sa voix à un personnage du dessin animé Fourmiz en 1998.

En 1999, Samuel Labarthe interprète le mari d'Emmanuelle Béart dans une comédie festive et familiale, La Bûche de Danièle Thompson dont c'est la première réalisation, avant de rentrer en compétition avec Patrick Chesnais pour gagner le coeur d'Alexandra Vandernoot dans Charmant garçon. Depuis 2001, il enchaîne les films mais toujours dans des rôles secondaires (J'ai faim !!!, Comme un avion, Rue des plaisirs, And now... Ladies and Gentlemen). En 2003, il est à l'affiche des Egarés d'André Techiné (où il retrouve Emmanuelle Béart) et enchaîne le tournage en anglais du Divorce de James Ivory, tourné à Paris, avec un casting international. En 2005, il obtient le rôle d'Olivier, personnage central masculin du film de troupe de Jacques Otmezguine, Trois couples en quête d'orage.

L'année suivante, le comédien retrouve un second rôle en tant que principal dans L'École pour tous de Eric Rochant puis comme proche de Françoise Sagan dans le film éponyme (Sagan). Après quelques téléfilms, il rejoint le casting de Deux jours à tuer de Jean Becker, aux côtés d'Albert Dupontel, de Marie-Josée Croze et d'Alessandra Martines. Deux ans après, il donne la réplique à Audrey Dana dans la fresque romanesque de Claude Lelouch: Ces amours-là. En 2010, il joue ensuite tour à tour deux personnages politiques français: d'abord l'ancien président Jacques Chirac dans Mort d'un président, puis l'ex-premier ministre Dominique De Villepin dans La Conquête.