D'origines écossaises et hawaïennes, David Strathairn suit des cours de comédie au Williams College, où il a notamment pour camarade le réalisateur John Sayles, qui fera souvent appel à lui dans ses films. Une fois son diplôme en poche, Strathairn s'engage en Floride dans une troupe de cirque ambulante, avec laquelle il part six mois sur les routes. Arrivé à New York, il passe plusieurs années à jouer au théâtre, partant souvent faire des tournées estivales à travers le pays.

C'est donc John Sayles qui le fait démarrer en 1980, dans son premier long métrage Return of the secaucus seven. Il lui offrira ensuite plusieurs rôles, notamment dans Matewan (1987), Eight Men Out (1988), City of Hope (1991) ou encore Passion Fish. C'est dans ce dernier film, sorti en 1992, que Strathairn est révélé à la critique et au public, d'autant plus qu'il apparaît la même année dans Une équipe hors du commun et dans Les Experts. La collaboration entre les deux hommes trouve en 1998 un nouvel aboutissement avec Limbo. Strathairn y obtient l'un de ses plus beaux rôles auprès de Mary Elizabeth Mastrantonio, bien que le film ne reçoive une nouvelle fois qu'un écho limité.

David Strathairn enchaîne ensuite les rôles plus ou moins importants dans des films prestigieux des années 90. Non seulement il collabore à La Firme de Sydney Pollack en 1993, mais il incarne l'année suivante le mari de Meryl Streep, pris au piège par Kevin Bacon et John C. Reilly dans le thriller La Rivière sauvage. Il apparaît aussi au générique de Dolores Claiborne de Taylor Hackford (1995), puis de L.A. Confidential de Curtis Hanson (1997), dans le rôle très mystérieux du milliardaire Pierce Patchett. En 2001, Elie Chouraqui lui fait interpréter un grand photographe couvrant un reportage au beau milieu de la Yougoslavie en guerre dans Harrison's Flowers, aux côtés d'Andie MacDowell.

En 2005, Strathairn se voit enfin offrir un rôle principal dans le Good night, and good luck. de George Clooney, rôle pour lequel il obtient le prix du Meilleur Acteur lors de la 62e Mostra de Venise. Après quelques incursions dans la série Les Soprano, Wong Kar-Wai l'éloigne des magouilles en 2007 pour l'immerger dans un rôle sensible d'alcoolique au cœur brisé dans My Blueberry Nights. Mais, véritable spécialiste du thriller, il s'engouffre juste après dans La Faille, avant de reprendre une dose de suspense avec La Vengeance dans la peau (2007). Après ce film d'action, Strathairn se tourne vers des longs métrages plus fantastiques comme Les Chroniques de Spiderwick (2008), ou Les Intrus l'année suivante.

En parallèle de ses rôles au cinéma, l'acteur continue d'apparaître à la télévision dans les séries Dr House et Monk. Il retrouve sa partenaire de My Blueberry Nights, Rachel Weisz, dans le thriller Seule contre tous (2010). N'hésitant pas à changer de registre, Strathairn se plonge au cœur du San Francisco des années 50 et de la naissance de la Beat Generation dans Howl, aux côtés de James Franco. Habitué aux seconds rôles dans de nombreuses séries, l'acteur est mis en avant dans Alphas (2011), qui le plonge en pleine science-fiction. L'année suivante, il reprend son rôle de Noah Vosen dans Jason Bourne : l'héritage, nouvel opus de la franchise à succès.