Formée à l'American Conservatory Theatre de San Francisco, Annette Bening a d'abord travaillé comme comédienne au théâtre.

En 1988, elle fait sa première apparition sur les écrans, dans la comédie The Great outdoors. Mais c'est l'année suivante, dans Valmont, le film de Milos Forman adapté des Liaisons dangereuses, qu'elle se fait connaître. Le rôle de la perfide Madame de Merteuil lui permet de faire ses preuves.

En 1990, elle s'illustre dans deux comédies, Bons baisers d'Hollywood, où elle croise Meryl Streep, et Les Arnaqueurs, pour lequel elle est nommée à l'Oscar de la meilleure actrice. Un an plus tard, elle incarne la femme d'Harrison Ford, dans le drame A propos d'Henry. Toujours en 1991, elle interpète Virginia Hill dans Bugsy. Elle y fait la connaissance de Warren Beatty qu'elle épouse l'année suivante : ils auront quatre enfants.

Annette Benning est une actrice assez rare à l'écran, elle se consacre en effet à la vie de sa grande famille. Elle joue aussi bien dans des comédies - comme Le Président et Miss Wade (1995) - que dans des films plus noirs - telle la transposition dans les années 30 de Richard III -. En 1996 notamment, elle brise son image de bourgeoise dans la comédie satirique de Tim Burton, Mars Attacks!. Trois ans plus tard, elle s'essaie à un genre encore plus fantastique : elle tient en effet le rôle principal du film de Neil Jordan, Premonitions.

La même année, Annette Bening est citée à l'Oscar et au Golden Globe de la meilleure actrice pour son interprétation de mère de famille infidèle dans American beauty. Seule femme dans le western de Kevin Costner, Open range (2003), elle trouve dans ce film une rare intensité dramatique. Nouvelle récompense pour son interprétation dans Adorable Julia (2005) où elle incarne une actrice tourmentée dans les années 30: sa prestation de comédienne lui vaut une nouvelle fois le Golden Globe de la Meilleure Actrice et une nomination aux Oscars.

Par la suite, Annette Bening tient le rôle de la mère excentrique de Joseph Cross dans le film Courir avec des ciseaux de Ryan Murphy, puis fait partie deux ans plus tard du casting très féminin de The Women aux côtés, entre autres, de Meg Ryan, Eva Mendes et Jada Pinkett. Alternant les genres en 2010, elle interprète l'une des trois mères courage dans le drame Mother & Child, avant de jouer la compagne de Julianne Moore dans la comédie dramatique Tout va bien, The Kids Are All Right.

Variant les projets, Annette Bening incarne plusieurs seconds rôles dans Elle s'appelle Ruby, Un été magique et Ginger and Rosa. Elle joue aussi aux côtés de Robin Williams et Ed Harris dans le drame romantique The Face of Love ainsi que dans le film de guerre The Search de Michel Hazanavicius. Côtoyant Al Pacino en rock-star vieillissante dans Danny Collins, Annette Bening campe ensuite l'un des personnages principaux du film féministe encensé par la critique 20th Century Women. 

En 2017, Annette Bening retrouve Warren Beatty pour son biopic sur Howard Hugues, L'Exception à la règle, puis prend part à Seule la vie..., une histoire d'amour multi-générationnelle au casting impressionnant. En 2019, la comédienne de 60 ans change de registre et rejoint la distribution du blockbuster Captain Marvel, centré sur l’histoire de Carol Danvers qui va devenir l’une des super-héroïnes les plus puissantes de l’univers.